孙 杨 龚 丹 高福祥

沈阳华生生物科技开发有限公司 辽宁 沈阳 110000

蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link],又名北冬虫夏草、北虫草,在分类学上属于子囊菌门(Ascomycota)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、虫草科(Cordycipitaceae)、虫草属(Cordyceps)[1]。冬虫夏草作为中国传统滋补上品一直备受推崇,经现代科学研究表明,蛹虫草含有与冬虫夏草同类的营养物质,如虫草素、虫草酸、虫草多糖、SOD和腺苷等等,甚至有些有效物质的含量较冬虫夏草更高[2-5]。

目前在辽宁地区已实现大规模的蛹虫草人工栽培,并取得了较为广泛的群众基础。但在大规模栽培的过程中,仍存在优质菌种少、菌种遗传不稳定、遗传变异明显以及退化风险大等问题,导致菌种生产不能满足市场需求。基于上述原因,笔者对自采菌种进行筛选,选择性状较优的菌株A170815作为实验对象,在现有实践经验的基础上分别对其液体培养和子实体栽培培养进行优化,筛选最适条件用于生产实践,以期解决菌种市场的现有问题。

1 仪器与材料

SW—CJ—2DF型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司);立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);SHZ—A 旋转气浴恒温振荡器(杭州汇尔仪器设备有限公司);移液器(DRAGONLAB)。

马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：葡萄糖2.0g、琼脂2.0g,马铃薯浸汁定容至100 mL。(马铃薯浸汁：去皮马铃薯20.0g,加蒸馏水100 mL煮沸30 min,八层纱布过滤得浸汁。)

固体筛选培养基：碳源2%,氮源2%,VB1 0.005%,磷酸二氢钾0.01%,硫酸镁0.01%,琼脂2%。

液体筛选培养基：碳源2%,氮源2%,VB1 0.005%,磷酸二氢钾0.01%,硫酸镁0.01%。

栽培基础培养基：小麦40g,水72 mL。

菌种：自主采集并分离成功的菌株A170815。

2 方法

2.1 最适碳源和氮源及用量的筛选

2.1.1 固体平板初筛 将灭菌后的筛选培养基倒入无菌平皿中,静置凝固后接入同一菌龄且同样大小的菌块,18-20℃,静置暗培养,比较同样培养时间下的菌落平均直径。

2.1.2 液体摇瓶复筛 取同一菌龄且同样大小的菌块接种于灭菌后的液体筛选培养基中,18-20℃,摇床暗培养4-6天,比较菌丝量的多少。并将培养后的菌液接种于栽培基础培养基上,进行出草验证,比较子实体生长状态和生物转化率。

2.1.3 用量筛选 配制含有不同浓度碳源(或氮源)的筛选培养基,灭菌后倒入无菌平皿中,静置凝固后接入同一菌龄且同样大小的菌块,18-20℃,静置暗培养,比较同样培养时间下的菌落平均直径。

2.2 最适栽培料的筛选

2.2.1 液体菌种培养 在优选的液体培养基条件下接入菌种,18-20℃,摇床暗培养4-6天,得菌种培养液。

2.2.2 栽培料筛选实验 分别用等量的小麦+水、燕麦+水、糙米+水、大米+水以及小麦+液体培养基组成栽培培养基,灭菌后接入同样数量菌种培养液,进行出草验证,比较子实体生长状态和生物转化率。

2.2.3 子代菌种验证 在2.2.2步骤中的子实体生长至40-45天时,通过组织分离法[6-7]获得子代菌种,将同一菌龄且同样大小的子代菌块重复2.2.1培养,获得的培养液均接入栽培基础培养基中,进行出草验证,比较子实体生长状态和生物转化率。

3 结果

3.1 最适碳源和氮源及用量的筛选

3.1.1 碳源筛选：分别选用可溶性淀粉、蔗糖、白砂糖(食用级)、麦芽糖和葡萄糖作为碳源,蛋白胨为氮源,无碳源组为对照组,配制不同筛选培养基。接入同一菌龄且同样大小的菌种块,培养后比较菌落平均直径,结果如图1所示,由实验结果可知蔗糖组菌落平均直径最大。

图1 不同碳源的固体筛选培养基上菌落平均直径

不同的液体筛选培养基培养获得的菌液中,蔗糖组、白砂糖组、葡萄糖组的菌丝量均较多,其次为可溶性淀粉组,麦芽糖组和无碳源组菌丝量明显较少。将培养后的菌液接种于栽培基础培养基上,进行出草验证,对子实体生长状态进行评价并测定生物转化率,结果如图2所示,由实验结果可知蔗糖组表观形态平均分最高且平均生物转化率也最高。

图2 不同碳源培养液子实体平均生物转化率和表观形态评价

通过固体平板初筛和液体摇瓶复筛并经栽培出草验证,蔗糖组表现明显优于其他组,所以确定蔗糖为最适碳源,后续实验均采用蔗糖作为碳源。

分别以0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%以及3%的蔗糖为碳源,蛋白胨为氮源,配制固体筛选培养基,接入同一菌龄且同样大小的菌块培养后测量菌落平均直径,结果如图3所示,蔗糖含量为2%时菌落最大,故确定蔗糖的最适浓度为2%。

图3 不同蔗糖含量的固体筛选培养基上菌落平均直径

3.1.2 氮源筛选：分别选用大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、牛肉蛋白胨、酵母蛋白胨和实验室原用的蛋白胨作为氮源,蔗糖为碳源,无氮源组为对照组,配制不同筛选培养基。接入同一菌龄且同样大小的菌块,培养后比较菌落平均直径,结果如图4所示,由实验结果可知无氮源组菌落直径最大,但该菌落菌丝极薄且不转色,故选择酵母蛋白胨作为氮源继续实验。

图4 不同氮源的固体筛选培养基上菌落平均直径

不同氮源的液体筛选培养基培养获得的菌液中,除无氮源组菌丝量较少外,其余各组的菌丝量均较多,单从菌丝数量上不易判断孰优孰劣。将培养后的菌液接种于栽培基础培养基上,进行出草验证,对子实体生长状态进行评价并测定生物转化率,结果如图5所示,由实验结果可知酵母蛋白胨组表观形态较好且平均生物转化率也最高。

通过固体平板初筛和液体摇瓶复筛并经栽培出草验证,酵母蛋白胨组表现优于其他组,所以确定酵母蛋白胨为最适氮源,后续实验均采用酵母蛋白胨作为氮源。

分别以0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的酵母蛋白胨为氮源,蔗糖为碳源,配制固体筛选培养基,接入同一菌龄且同样大小的菌块培养后测量菌落平均直径,结果如图6所示,酵母蛋白胨含量为0时菌落最大,但该菌落菌丝极薄且不转色,故确定酵母蛋白胨的最适浓度为0.5%。

图5 不同氮源培养液子实体平均生物转化率和表观形态评价

图6 不同酵母蛋白胨含量的固体筛选培养基上菌落平均直径

3.2 最适栽培料的筛选

3.2.1 栽培料筛选实验 以蔗糖(2%)为碳源、酵母蛋白胨(0.5%)为氮源,其余组分同液体筛选培养基,配制液体培养基,接种培养获得菌液。取同样数量菌液接种于不同的栽培培养基中,经出草验证,除大米组外,其余组子实体形态均较优,且小麦培养的子实体均较为粗壮,但生物转化率组间差别较大,燕麦组最高可达163%,该组实验子实体表观形态平均分和生物转化率如图7所示。

图7 栽培实验子实体生物转化率和表观形态平均分

3.2.2 子代菌种验证

2.2.2 步骤中子实体的子代菌种在转色阶段略有差异,大米组转色差,其余组均正常。将子代菌种培养液接入栽培基础培养基中,通过出草验证可知,糙米和燕麦培养的子代表观形态较优,且燕麦培养获得的子代菌种生物转化率仍最高,实验结果如图8所示。结合当代子实体综合数据和子代子实体综合数据认为燕麦+水组成的栽培培养基最适宜。

图8 栽培实验子代菌种子实体生物转化率和表观形态平均分

4 小结与讨论

4.1 在液体培养时采用蔗糖(2%)作为碳源、酵母蛋白胨(0.5%)作为氮源,获得培养液后栽培至燕麦和水组成的栽培培养基上,可以获得综合评价最高的子实体,且该菌株能够将优势保持至下一代,既保证了当代子实体的经济价值又大大降低了菌种遗传风险。

4.2 在碳源或氮源筛选中,固体平板筛选结果清晰明了但不能保证出草结果,而液体培养结果不易观察但可结合栽培实验明确出草结果,仅使用单一方法不能保证实验结果的准确性,故采用固体平板初筛和液体摇瓶复筛结合的方法,增强实验结果的可靠性。

4.3 在不同氮源含量筛选过程中,无氮源固体培养基上生长的菌落大、菌丝极薄且不转色,与原始菌落和其他组差异极大。对该菌落进行了相关实验,其能够正常生长、出草和传代,但与其他组别相比较,菌丝不够强壮,后代变异风险较大。