孙庆云闫振宇

(1. 华北理工大学，河北唐山 063000；2. 华北理工大学附属医院，河北唐山 063000)

血友病是一种遗传性X 染色体相关出血性疾病，主要是由FVIII 或FIX 异常引起。 全球约有40 万人受累，男性发病率远大于女性，大约每5000 个男性新生儿中有1 例为血友病A 患者，大约每30000 个男性新生儿中有1 例为血友病B 患者[1]。 在临床上，血友病A和B 难以区分，诊断必须通过分析特异性因子来确定，根据Ⅷ因子和Ⅸ因子的水平分为：重型(≤1%)、中型(2% ～5%)、轻型(6% ～40%)[2]。 重型血友病常表现为为关节和肌肉自发性出血，复发性出血导致滑膜肥厚、软骨损伤、关节间隙丢失和骨质改变，靶关节活动的减少导致肌肉持续性萎缩、关节强直、骨质疏松，最终导致血友病性关节病[3-7]。

血友病性关节病发病机制复杂，包括软骨代谢紊乱，软骨细胞凋亡加速，滑膜细胞异常增殖以及滑膜液中炎性分子水平增加等，同时，其发病的危险因素也较多，例如治疗情况，功能锻炼，肥胖，年龄等[8]。 其患者的四肢任何关节都可发生关节积血，其中膝、肘和踝关节居多，而髋部、肩部和腕部受累较少见[9]。 从长期来看，治疗不当的患者常常会因进展性关节病而丧失活动能力[10]。 目前血友病性关节病的治疗包括预防治疗，物理治疗，关节腔穿刺，关节置换术等[11]。 对于血友病，最主要的治疗还是预防治疗，如果不进行预防，大多数重型血友病患者将在2 ～5 岁之间发生关节内出血，并在其二三十岁时发生血友病性关节病[12]。Manco-Johnson 等[13]发现血友病患者关节或软骨下骨中的慢性微出血会导致没有临床证据的关节恶化，而预防治疗可以阻止这一亚临床过程。 主要的检测方法是通过放射学或磁共振成像(MRI)来评估关节的损伤程度，当显示软骨下囊肿、表面糜烂或关节间隙变窄即可定义为关节损伤，根据关节的出血次数和关节结构的改变，得知预防治疗和按需治疗均有不同程度的关节结构改变，但预防治疗的关节结构的正常率大于按需治疗的患者。 且有研究表明，90%以上接受预防性治疗的患者在30 ～40 岁时出现关节病变[14-15]。 随着进行性关节病患者的健康相关生存质量(HRQoL)的恶化[16-17]，以及为缓解疼痛和改善关节功能而进行的骨科干预治疗所需的相关费用的高昂，使血友病性关节病的预防治疗成为血友病治疗的主要目标。

目前，胶原诱导性关节炎模型是国际上公认的关节炎模型[18]。 但由于血友病的自发性出血，不适于这种构建方式。 目前已经成功构建的血友病动物模型包括血友病犬、绵羊、大鼠、小鼠和猪，但其中血友病犬、绵羊，猪多由自发性基因突变形成，而血友病鼠通常是通过破坏靶向基因而构建相应的模型[19]。 在相关研究中，犬类、绵羊、猪类模型容易受到实验动物数量的限制，而兔类模型容易受到模型构建的限制[20]，因而通过使用血友病鼠类模型，创建一个新的血友病性关节病动物模型成为研究者的最佳选择，以便进一步研究血友病性关节病的发病机制以及预防治疗。

1 血友病性关节病小鼠模型的建立

2008 年，Hakobyan 等[21]通过使用F8 基因敲除的重型血友病A 小鼠(E16 FVIII B6；129S4-F8tm1kaz/J)[22-23]，由 Dr Haig Kazazian ( University of Pennsylvania，Philadelphia，PA，USA)提供，F9 基因敲除的重型血友病B 小鼠(B6；129P2-F9tm1Dws/J)[24]，由 Darrel Stafford(Department of Biology，University of North Carolina at Chapel Hill)提供，和野生型小鼠(C57BL/6J)，购买自Jackson 实验室(Bar Harbor，ME，USA)。 三种小鼠菌株成功构建血友病性关节病小鼠模型。 该研究得到了Institutional Animal Care 和Use Committee of RUSH University 的审查和批准，实验中所有小鼠都按照委员会的指导方针进行了维护和治疗。A、B 型血友病小鼠关节病模型的构建方法相同。 在实验中通过用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉3 ～4 月龄的小鼠，剪除双侧膝关节毛发，使用30 g 针在每只小鼠的右膝关节囊髌骨下穿刺一次出血。 部分小鼠在关节损伤前接受人重组因子VIII(recombinant human coagulation VIII，rhFVIII)静脉注射，剂量为280 U/kg(相当于100%校正)，每只动物左膝作为未受影响的对照组，检查被穿刺关节是否出血，并在穿刺后24 h 皮下注射止痛剂。动物在受伤后特定时间被处死，并测量小鼠膝关节从外侧到内测的最大直径[20]，随后对小鼠的膝关节进行组织学检查，并进行数字成像、X 线平片和显微计算机断层扫描成像，并对结果进行分析。 结果显示在单个且大量的关节积血后，血友病小鼠在14 d 后发生关节病，显微CT 也证明关节结构损伤与Manco-Johnson 的研究结果一致[13]。 通过这些研究指标初步证明，血友病性关节病小鼠模型的成功构建。

2 血友病性关节病小鼠模型的应用研究

血友病性关节病小鼠模型的成功构建，推动了研究者对于该种疾病的研究进展，为此后关于该疾病的各项实验，提供了必要的动物模型支持条件。 2008 年，Sun 等[25]使用该模型，向小鼠关节内或静脉注射人凝血因子IX(human coagulation IX，hFIX)，发现接受关节内注射的小鼠免于滑膜炎的侵害。 随后在此基础上，他们将表达hFIX 的腺相关病毒(AAV)基因转移载体注射到血友病B 小鼠的膝关节，结果显示用载体治疗的关节在损伤后2 周出现的病理改变明显减少，证明在没有循环FIX 的情况下，血管外因子活性和关节导向基因转移可改善血友病性关节病。 2013 年，Coeleveld 等[26]在细胞因子的联合应用在早期软骨损伤过程中是否有效的实验研究中，通过针刺诱导血友病小鼠关节出血，将IL-4 和IL-10 的混合溶剂和对照溶剂分别注射到关节腔内，通过观察35 d 后关节的损伤程度，同时检测关节退化所需的时间，证明关节出血后单次关节内注射IL-4 和IL-10 的混合试剂可限制血液诱导的软骨退变，而且提高两种因子的生物利用度会提高其在软骨退变中的保护作用。 由于许多编码细胞因子、生长因子和缺氧调节因子的基因均可被NFκB 激活，且其中许多基因是关节疾病发病机制的一部分，因此推断NF-κB 相关通路可能在血液诱导的关节损伤中起关键作用。 为进一步了解其作用机制，Sen等[27]在2013 年使用血友病性关节病小鼠模型，监测伤后一定时间内NF-κB 相关因子的表达，结果发现显著上调，由此表明NF-κB 相关的信号通路参与血友病性关节病的发生。 随后在2016 年，Hakobyan 等[28]再次使用血友病小鼠关节积血模型，对可见出血评估(VBA)，关节直径(JD)，关节外出血评分(EBS)和关节内出血评分(IBS)4 项指标进行了评估，将EBS 和IBS两项指标总结为关节出血评价系统(BSS)，为临床前止血药物的开发提供了一个新的、有价值的补充。 2018年，Haxaire 等[29]发现针刺诱导关节出血导致FVIII 缺陷小鼠损伤关节中TNF-α 水平升高，且TNF-α 或iRhom2 失活可减少血友病性关节病小鼠模型中出现的骨质减少和滑膜炎症，由此可知血液进入关节激活了iRhom2/ADAM17/TNF-α 途径，从而导致小鼠骨质减少和滑膜炎，因此，该促炎信号通路成为预防血友病关节病患者骨质疏松和关节损伤的新靶点。

上述多项研究中应用了血友病性关节病小鼠模型，说明其模型适用于该疾病实验研究，具有可用性。其体型大小使其易于运输。 但是不可否认，其仍具有尚未完善的部分。 小鼠模型的主要缺点是缺乏自发性出血表型，并且只能分析小体积的血液样本，这限制了该模型的适用性，从而无法深入了解再出血的机制[30]。虽然血友病犬表现自发性出血表型，且与人类有明显的F8 基因同源性，每年出血发作1 ～5 次，但是其繁殖率较低并且支持研究所需的设施昂贵，并且很难在研究中接触到大量动物。 血友病绵羊与血友病猪具有体型和自发性出血表型的优势，但管理起来相当费力[19，31-32]。 因此，就要求其他合适的关节病动物模型的构建，使其更适于其他深入研究。 有研究表明[30]，血友病大鼠与人类血友病患者具有相似的表型，表现为血液循环受损和自发性肌肉骨骼出血，与血友病小鼠相比，血友病大鼠的身体和血容量约为小鼠的10 倍，且允许更大和更频繁的血液采样。 根据指导方针[33]，25 g 的小鼠一周内只能采集135 IL 的血液样本，而250 g 的大鼠一周可以采集1200 IL 的血液样本，这有助于在纵向疾病进展研究中大鼠作为自身基线对照，从而改进研究设计，并减少所需要的动物数量。 此外，大鼠具有与小鼠相同的繁殖和住房优势，且大鼠体型较大也可进行临床相关成像。 由此可知，血友病性关节病大鼠模型将更受到研究者的青睐。

3 血友病性关节病大鼠模型的构建

2016 年，Sørensen 等[34]人通过使用13～15 周龄的F8-/-大鼠(SD-F8tm1sage)在Sprague Dawley 背景下，饲养于Novo Nordisk A/S(Maaloev，Denmark)，和野生型大鼠成功构建血友病关节病大鼠模型。 该研究得到了Danish Ministry of Justice 的批准，实验中所有动物都根据Danish Animal Experiments Council 的指导方针进行。 大鼠饲养在标准条件下，光照/黑暗周期为12 h/12 h，温度为20 ～23 ℃，相对湿度为30% ～60%，自由进食和饮水，每天监测出血体征。 F8-/-大鼠的数据曾报道过，证实F8-/-大鼠是血友病A 的转化动物模型[30]。 在实验中用5%异氟烷、0.7 L/min O2、0.3 L/min N2O 诱导，2%异氟烷、0.7 L/min O2、0.3 L/min N2O 维持麻醉，在吸入麻醉下进行所有入侵手术。 将20 只野生型大鼠和60 只F8-/-大鼠，随机分配到两个损伤类型，一组(10 只野生型大鼠和40 只F8-/-大鼠)在第0 天接受单次针刺诱导出血，在第14 天处死。 另一组(10 只野生型大鼠和20 只F8-/-大鼠)在第0 天和第14 天分别接受针刺诱导出血，在第28 天处死，目的是研究再次出血是否会加重血友病性关节病的进展。在接受针刺诱导出血前，F8-/-大鼠按1 ∶1随机分配，接受300 IU/kg rhFVIII 或者相同体积的缓冲液治疗。rhFVIII 的剂量是基于F8-/-大鼠血浆中APTT 的体外正常化[30]，野生型大鼠给予缓冲液。 然后对大鼠进行麻醉，静脉注射rhFVIII 或缓冲液后，皮下注射丁丙诺啡0.03 mg/kg 镇痛，有研究表明丁丙诺啡作为镇痛剂不会影响膝关节出血后的炎症影响[35]。 剪掉左膝上的毛发，用30 g 针穿过髌骨韧带，引发关节出血。 在接下来7 d，在饮用水中添加6 mg/L 的丁丙诺啡。

根据慢性关节病变评分系统[36]，组织学评估及日常评估得出，所有未经治疗的血友病关节病动物切片的组织病理学评估符合血友病[37-40]。 预防性使用rhFVIII 治疗显著降低了关节的病理，并显示关节出血临床症状的减少，从而证实了F8-/-大鼠作为血友病关节病相关模型的潜力。 初步证明血友病性关节病大鼠模型构建成功。

4 血友病性关节病大鼠模型的应用研究

众所周知，凝血因子VIII 替代治疗血友病A 最严重并发症是产生中和抗体，为进一步研究出血是否会促进抑制物的形成，2016 年，Lövgren 等[41]将血友病大鼠分为两组，其中一组接受针刺出血，另一组作为对照，随后均给予rhFVIII 治疗，通过分析结果证明关节出血后给予rhFVIII 治疗可加强抑制物的形成，这表明出血是潜在的危险信号，即rhFVIII 替代疗法同时并发出血可增加抑制物的形成。 随后Christensen 等[42]在2017 年使用体内US(Ultrasonography，US)和体外μCT检测血友病性关节病大鼠的膝关节，观察到与血友病性关节病相关的病理，并且μCT 确定的疾病严重程度与组织病理学之间存在强相关性，rhFVIII 治疗可降低两种成像技术确定的病理，证明US 和μCT 是检测血友病性关节病的合适成像技术，可用于疾病进展的纵向研究。 研究发现，大多数产生抑制物的血友病患者不能诱导免疫耐受，需要旁路制剂进行长期出血管理。重组人活化凝血因子VII (recombinant human coagulation VII，rhFVIIa)是血友病抑制物患者出血的按需旁路止血剂。 预防性使用rhFVIIa 可以使产生抑制物的患者得到持续的止血治疗，但在这种情况下，rhFVIIa 循环水平和临床结果的关系仍不清楚。 为了解决这一问题，Zintner 等[43]在2019 年使用该大鼠模型，通过腺相关病毒(AAV)基因转移模拟了大鼠FVIIa转基因的活化因子VII 预防，与未经处理的血友病性关节病大鼠相比，重组大鼠FVIIa 按需给药可缓解出血。当大鼠FVIIa 转基因水平≥708 ng/mL 可减少血友病大鼠的出血，而水平＞1250 ng/mL 则可消除出血。 这些数据首次确定了在模拟FVIIa 预防的环境中，血友病性关节病动物的FVIIa 循环抗原水平和出血比例之间的关系。

上述各项研究表明，血友病性关节病大鼠模型的成功构建为以后的一系列深入研究提供了必要前提。 首先，血友病性关节病大鼠模型可表现出与人类类似的自发性出血表型，其次，大鼠的繁殖优势可使我们快速获得具有统计学意义的大队列数据，以识别治疗引起的临床变化。 相关优势使得该模型有助于对血友病性关节病的发病机制及治疗干预的研究。 但是，由于是自发性出血模型，非预期出血可能给实验带来偏倚，且出血量大小未知，这是在以后的实验中需要克服的一大难题。

5 总结及展望

目前血友病性关节病是血友病最严重的并发症，其并病理生理机制尚不完全清楚，因此构建相应的动物模型，进一步研究其机制，成为了研究者最关注的问题。 实验鼠因其自身优势，如繁殖量大，便于管理等成为实验中最常用的实验动物。血友病小鼠关节病模型已成功构建，但小鼠采血量小且缺乏自发性出血表型，进而选择体积相对较大的SD 大鼠，但因其自发性出血，出血量大小未知，也为实验带来了一定的困难。 虽然各种动物模型均有利弊，但是实验动物模型为实验研究带来的优势不容小觑。 总之，建立一种生理指标稳定、模型构建简单、且易操作的血友病性关节病模型有助于我们对血友病性关节病的发病机制、病理改变的进一步认知，也为新型疗法的开发比如基因治疗提供了可能，并且为今后的临床研究打下了坚实的基础。