刘 元 ，刘 淼，阮 元，张少宁，王旭光，文春南，麻兵继，*

（1.河南农业大学中药材系，河南 郑州 450002；2.河南白云牧港生物有限公司，河南 登封 452470）

植物内生真菌在长时间的进化过程中和宿主植物建立了共生关系，不仅能独立产生丰富的次生代谢产物，而且还能参与宿主植物的代谢过程，对植物的生长发育、抗病抗逆、有效成分的产生和积累起到促进作用［1］。山药为薯蓣科薯蓣属植物薯蓣Dioscorea oppositaThunb.的根茎［2］。古河南怀庆府地区（今博爱、武陟、温县）所产山药最佳，故谓之“怀山药”，为著名的四大怀药之一［3］，也是我国传统的药食同源品种之一。文献报道怀山药中含有薯蓣皂苷、尿囊素、胆碱、糖蛋白、自由氨基酸、山药碱、山药多糖等多种成分［4-5］，具有健脾益胃、生津益肺、补肾涩精等功效，素有“怀参”之誉。

目前，对怀山药内生真菌的研究较少。本课题组前期采用高通量测序技术，测定了怀山药根、茎中主要内生真菌分布。其中优势内生真菌有链格孢属（根17.1%、茎33.2%），葡萄孢盘菌属（根34.1%、茎6.3%），毛球壳属（根20.0%、茎0.3%）［6］。本课题组通过传统的分离方式从怀山药的根、茎中纯化获得了38 株可培养的内生真菌［7］。文献报道植物内生真菌对宿主植物具有促生长作用［8］，3-吲哚乙酸是人们最早发现的植物生长激素，可调控植物细胞的分裂、伸长、分化、根原基发生及胚的形成过程［9］。为深入研究内生真菌与怀山药的共生关系，本实验对前期分离得到的38 株怀山药内生真菌进行产生长激素3-吲哚乙酸的筛选，并以PDB（马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基）、SDB（沙氏液体培养基）、SNB（合成低营养液体培养基）、MB（麦芽浸汁液体培养基）4 种不同培养基考察阳性菌株分泌3-吲哚乙酸的能力，进而借助HPLC 测定其最大分泌量，旨在发现对怀山药促生作用明显的菌株。

1 材料

1.1 供试菌株 怀山药的根、茎中分离得到的38 株内生真菌。

1.2 供试培养基 PDB 培养基，马铃薯200 g，葡萄糖20 g，加蒸馏水至1 L，自然pH，121 ℃灭菌20 min。SDB培养基，葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，加蒸馏水至1 L，自然pH，121 ℃灭菌20 min。SNB 培养基，KH2PO41 g，KNO31 g，MgSO40.5 g，蔗糖0.2 g，葡萄糖0.2 g，加蒸馏水至1 L，自然pH，121 ℃灭菌20 min。MB 培养基，麦芽浸膏25 g，蒸馏水1 L，自然pH，121 ℃灭菌20 min。

1.3 仪器 LDZF-50KB 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；QHZ-98 A 全温震荡摇床（太仓市华美生化仪器厂）；GXZ 型多段编程智能光照培养箱（宁波江南仪器厂）；RE-2000A 旋转蒸发器（郑州予华仪器制造有限公司）；Waters 1525 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；分析天平（万分之一，上海菁海仪器有限公司）。

1.4 试剂 Salkowski 试剂，称取FeCl312 g，溶于500 mL蒸馏水中，然后缓慢加入430 mL 98% H2SO4，冷却后定容至1 L，配置成标准比色液（测定范围为 0.3～20 mg/L）［10］。乙酸乙酯（分析纯，天津富宇精细化工有限公司）；乙腈（一级色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司）。

2 方法与结果

2.1 筛选怀山药内生真菌分泌3-吲哚乙酸 将38 株真菌接种到150 mL PDB 液体培养基上进行培养（250 mL 锥形瓶，30 ℃，120 r/min）8 d，用移液枪吸取200 μL 发酵液置白色坩埚内。1∶1 加入标准比色液，在暗处静置30 min后，观察其颜色变化，同时以空白PDB 培养液为对照。以200 μL 3-吲哚乙酸标准液（0.9 mg/L）加等量标准比色液作为阳性对照液，进行颜色比较。经过筛选发现1 株内生真菌LY-22 具有显著阳性颜色反应，并经分子生物学手段鉴定为镰刀属真菌锐顶镰刀菌Fusarium acuminatum。

2.2 锐顶镰刀菌在4 种培养基的发酵液中分泌3-吲哚乙酸测定

2.2.1 样品溶液制备 将锐顶镰刀菌分别在PDB、SDB、MA、SNB 4 种培养基液体中培养14 d（120 r/min，30 ℃），每种培养基同一批次共发酵21 瓶。每隔2 d 取其中3 瓶，以抽滤法分离菌液和菌丝，以乙酸乙酯和菌液1∶1进行萃取，共萃取3 次。将乙酸乙酯萃取液合并，浓缩蒸干后，用色谱级甲醇定容至3 mL。

2.2.2 3-吲哚乙酸对照品溶液制备 用天平准确称取4.50 mg 3-吲哚乙酸对照品，以色谱甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，制备成0.090 mg/mL 的3-吲哚乙酸甲醇溶液。

2.2.3 色谱条件 Venusil ASB -C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相水-乙腈（65∶35）；体积流量1 mL/min；柱温25 ℃；检测波长280 nm。在此条件下，样品中的3-吲哚乙酸与其他色谱峰能较好的分离，见图1。

2.2.4 精密度试验 取同一对照品溶液15 μL，在“2.2.3”项色谱条件下，重复进样5 次，测得3-吲哚乙酸峰面积RSD 为0.80%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验 取同一对照品溶液15 μL，在“2.2.3”项色谱条件下，分别于0、1、3、5、7 h 进样，测得3-吲哚乙酸峰面积RSD 为0.97%，表明溶液在7 h 内稳定性良好。

2.2.6 重复性试验 取相同条件下的PDB 发酵液3 份，按“2.2.1”项下方法制备样品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下，进样15 μL，测定3-吲哚乙酸的峰面积，按外标法计算含有量，RSD 为1.30%，表明该方法重现性良好。

2.2.7 线性关系考察 取“2.2.2”项下对照品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下，分别进样2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15 μL 测得3-吲哚乙酸峰面积，以对照品体积为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝185 371X-29 488（r＝0.999 6），表明线性关系良好。

2.2.8 4 种液体培养基中3-吲哚乙酸测定 锐顶镰刀菌在4 种液体培养基的发酵培养期间每隔2 d 测其发酵液中的3-吲哚乙酸含有量，测定结果表明在第10 天左右生长激素分泌量达到最高值并基本保持平稳，且在PDB 液体发酵液中产出量最高（经HPLC 测定，该真菌在PDB 液体发酵液中分泌3-吲哚乙酸的量约为1.80 mg/L），SDB 液体发酵液中含有量次之，但未在SNB 发酵液中检测到3-吲哚乙酸的存在，见图2。

3 结论与讨论

本研究从怀山药中分离得到的38 株内生真菌中经筛选发现1 株内生真菌锐顶镰刀菌具有显著分泌生长激素3-吲哚乙酸的能力。利用PDB、SDB、SNB、MB 4 种不同培养基对锐顶镰刀菌进行液体培养，测定该真菌分泌3-吲哚乙酸的能力，结果表明锐顶镰刀菌在PDB 培养基中发酵10 d左右，菌液中的 3-吲哚乙酸产量达到最高值，约为1.80 mg/L。

近年来在很多植物中，内生真菌对宿主有促生作用的报道。张春英等［11］研究发现盆栽杜鹃根部接种树粉孢属真菌菌株，对盆栽杜鹃花的生长具有明显的促进作用。陈志为等［12］将台湾相思树的不同优势内生真菌组合浇根回接于幼苗，发现对幼苗所测各项生理指标均显示促进作用。怀山药作为河南的道地药材之一，具有悠久的栽培历史，药材产地具有明显的地域性，但至今鲜有报道内生真菌对其具有促生作用。3-吲哚乙酸最明显的生态作用是促进植物生长，但对植物茎、芽、根不同部位生长的促进作用因浓度而异。在细胞水平上，3-吲哚乙酸可刺激形成植物层细胞分裂；刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长；促进木质部、韧皮部细胞分化，促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成；在器官和整株水平上，3-吲哚乙酸从幼苗到果实成熟都起作用［13-14］。本实验在怀山药中首次筛选得到具有产3-吲哚乙酸能力的内生真菌锐顶镰刀菌，但该内生真菌是否对怀山药植株的生长具有促进作用仍需要将菌种回接试验来验证，其具体的促生机制值得进一步深入研究。后续实验结果若表明3-吲哚乙酸对怀山药大田栽培的确发挥了明显的促生长作用，将来可开发成生物生长调节剂应用于怀山药的生产实践。