严勋，唐杰，李冰，王昌全，徐强，蔡欣，付铄岚

四川农业大学资源学院，成都 611130

近年来，重金属在世界上很多地方(包括中国)已造成严重的土壤污染问题[1]。Cd每年大约有3万t排放到环境中，其中约13 000 t来源于人类活动，如发电站、供暖系统、金属加工业、垃圾焚烧炉、城市交通、水泥厂和农业磷肥的施用等[2]。Cd比较容易被植物吸收并积累，当植物体内积累过量Cd后，会对植物自身产生严重的毒害作用，而Cd最终也会随食物链进入人体，对人体造成严重危害，威胁人类健康[3]。水稻是世界上主要的粮食作物，且易于积累Cd[4]，其根系对Cd有较强的吸收能力，并通过木质部将其转运到地上部最后积累于籽粒中[5]。因此，在粮食安全生产问题上，含Cd大米将对人类健康造成严重的安全隐患。

不同水稻品种对Cd吸收和积累存在差异[6]。研究表明，在Cd胁迫下，高积累品种能够更多地往地上部转运Cd[7]，低积累品种能够合成更多的非蛋白质巯基和谷胱甘肽等物质，从而限制Cd的迁移，而阳离子态Cd在高积累品种中含量更高[8-9]。OsNramp5和OsHMA2与Cd的吸收和转运相关，OsHMA3与Cd的液泡区隔相关[10-11]，研究发现，Cd胁迫能显著提升OsNramp5和OsHMA2在高积累品种中的表达量，而OsHMA3在低积累品种中的表达量更高[12]。这些不同水稻品种在Cd胁迫下的生理差异导致了不同水稻品种对Cd吸收积累的差异。

植物亚细胞组分中细胞壁对于重金属沉降起着重要作用[13]，当植物细胞壁上的重金属结合位点饱和时，细胞内的重金属会与大量的有机配位体结合形成稳定态的螯合物，并被转运至液泡中储藏，降低细胞质中自由重金属离子的浓度[14]。现有研究表明，重金属的亚细胞分布，有利于阐述重金属在植物体内的差异特征[15-17]，关于Cd在不同水稻品种亚细胞中的分布研究，大多单一地统计水稻组织亚细胞组分中的Cd含量[18-19]，从微观层次阐述Cd在不同水稻品种各组织部位亚细胞分布的差异，及其与Cd转运关系的报道结论也不统一。而且大部分研究仅以单一品种水稻为研究对象，具有局限性，关于比较不同基因型水稻差异的相关文章相对较少。因此，本研究通过盆栽试验，比较不同水稻品种各组织中Cd的分配规律及其与Cd亚细胞分布特征的关系，为培育Cd低积累水稻品种和水稻安全生产提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 供试材料

供试水稻材料为前期筛选得到的籽粒Cd低积累水稻品种越冬稻、R1088(下面统一简称“低积累品种”)和籽粒Cd高积累水稻品种IR34582、太粳558(下面统一简称“高积累品种”)，其生育期基本一致(150 d)，均由四川农业大学水稻研究所提供。

供试土壤为水耕人为土，采自成都市温江区公平镇惠合村(103.86845E, 30.72228N)，其基本理化性质如表1所示。

1.2 试验设计

试验于2016年4月至2016年10月在四川农业大学温室内进行，光、水、气和热等环境条件均为自然状态，无人为干扰。挑选颗粒饱满的水稻种子用30%的H2O2溶液消毒30 min，蒸馏水洗净后加0.1%的NaClO溶液杀菌20 h，再用37 ℃蒸馏水在恒温培养箱进行催芽处理48 h。选取露白的种子置于放有湿润石英砂的育苗盘中培养，待水稻种子出苗后，用1/4浓度的营养液进行浇灌培养，营养液的配制参照李冰等[20]的方法。在幼苗移栽前35 d对供试土壤作加Cd(CdCl2·2.5H2O)陈化处理，设置3个Cd处理水平：Cd0(不加Cd)、Cd5(5 mg·kg-1)和Cd25(25 mg·kg-1)，每个处理设3个重复，4个水稻材料共计36桶，供试土壤装在10 L的塑料桶中，每桶装7 kg(干土重)。待幼苗三叶一心时取长势一致、健康的水稻幼苗插秧移栽至培育好的Cd污染土壤中。氮、磷和钾肥分别选用尿素、磷酸二氢钾和氯化钾，用量分别为200、100和105 mg·kg-1土，全部的磷、钾肥和30%的氮肥在移栽前一天作为基肥施入，剩余氮肥在水稻分蘖期(30%)和拔节期(40%)分2次进行追施，随后按照常规管理，做好防治病虫害工作。于水稻成熟期收获样品进行室内分析测定。

表1 供试土壤基本理化性质Table 1 Basic physicochemical properties of the tested soil

1.3 测定项目及方法

1.3.1 土壤基本理化性质测定

土壤基本理化性质测定参照张甘霖和龚子同[21]的方法。

1.3.2 Cd在水稻植株各器官的亚细胞分布

亚细胞的分离参照Liu等[22]的方法。先将水稻根、茎、叶鞘和叶分别取样置于不同的分类袋中，然后在分类袋中称取混合均匀的根、茎、叶鞘和叶1.0 g鲜样，加入20 mL提取液后，在研钵中冰浴研磨成匀浆，提取液组成为50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)+250 mmol·L-1蔗糖+1.0 mmol·L-1二硫赤藓糖醇(DTE)+5.0 mmol·L-1抗坏血酸+1.0%(W/V)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)。匀浆液首先经240 μm尼龙布过滤，残渣为细胞壁部分(F1)；滤液经高速冷冻离心机(Model ALLEGRA-64R, Beckman Coulter. Inc. USA)4 ℃下以10 000 g离心30 min，沉淀部分为细胞器部分(F2)；取上清液再次经高速冷冻离心机4 ℃下以50 000 g离心30 min，沉淀部分为细胞膜部分(F3)，上清液为可溶部分(F4)(主要包括细胞质、有机物、无机离子和液泡内的大分子)。所有的化学试剂均采用优级纯，购自成都科隆化学品有限公司。

1.3.3 Cd含量测定

取细胞壁(F1)、细胞器(F2)和细胞膜(F3)部分在70 ℃下烘干的样品，以及水稻成熟期的根及地上部粉碎样共0.3 g，加10 mL HNO3-HClO4(4:1，V/V)混合液消化24 h，在高温条件下消煮至澄清并用去离子水过滤到50 mL容量瓶中定容，用原子吸收分光光度计(Analyst 800, Perkin Elmer, USA)测定Cd含量。以国家标准物质GSB-22(Cd含量为(0.018±0.002) mg·kg-1)为内标控制分析质量。所有的化学试剂均采用优级纯，购自成都科隆化学品有限公司。

1.4 数据处理及分析

运用SPSS 19.0进行数据统计与分析，采用LSD检验方法进行差异显著性分析(P<0.05)；运用Excel 2016进行数据处理与图表制作。

Cd转运效率：TFA-B=B器官中Cd含量/A器官中Cd含量×100%[23-24]。

根据实验数据进行不同水稻品种各组织间转运效率与亚细胞分布比例的相关性分析，其中，TF根-茎与细胞壁Cd分配比例相关性分析即为TF根-茎与根中细胞壁Cd分配比例相关性分析。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 不同浓度Cd处理中水稻各组织Cd含量及其转运效率

不同浓度Cd处理中水稻各组织部位Cd含量情况如表2所示。水稻各组织部位Cd含量均随Cd处理浓度的增加而增加，Cd主要集中于根系，低积累品种根系Cd所占比例约83%，而高积累品种根系Cd所占比例约65%，各组织部位Cd含量依次为根系﹥茎﹥叶鞘﹥叶﹥糙米。Cd5处理组中，低积累品种越冬稻和R1088根系Cd含量分别为27.2和26.5 mg·kg-1，显著高于高积累品种(P<0.05)，且低积累品种越冬稻和R1088糙米Cd含量分别为0.10和0.07 mg·kg-1，均低于国家标准(GB 2762—2012)的糙米Cd含量限值0.2 mg·kg-1；Cd25处理中，低积累品种越冬稻和R1088根系Cd含量分别为78.5和75.4 mg·kg-1，显著高于Cd高积累品种IR34582和太粳558(P<0.05)；然而，Cd5和Cd25处理中，低积累品种茎、叶鞘、叶和糙米Cd含量却显著低于高积累品种(P<0.05)。

表2 不同浓度Cd处理中水稻各组织Cd含量Table 2 Cd content in different tissues of rice under different levels of spiked cadmium

注：同列不同小写字母表示不同水稻品种在同一Cd浓度条件(0、5和25 mg·kg-1)下在P<0.05上差异显著；下同。

Note: Different small letters within one column mean different rice varieties in the same concentration of Cd (0, 5 and 25 mg·kg-1) showing significant differencebetween Cd treatments at the 0.05 level; the same as below.

不同浓度Cd处理中水稻各组织Cd转运效率情况如由图1所示。在Cd0处理时，高、低积累水稻各组织间Cd转运效率无显著差异；在5 mg·kg-1和25 mg·kg-1Cd胁迫下，低积累品种TF根-茎、TF茎-籽粒、TF叶鞘-籽粒和TF叶-籽粒均显著低于高积累品种。

2.2 不同水稻品种根系Cd亚细胞分布及其分配比例

不同水稻品种根系Cd亚细胞分布及其分配比例如表3所示。Cd胁迫下，低积累品种根F1、F2、F3和F4中Cd含量均显著高于高积累品种；根中亚细胞组分Cd分配主要集中于F1和F4(大约75%以上)，Cd分配比例依次为F1﹥F4﹥F3﹥F2；低积累品种越冬稻和R1088根F1分配比例均显著高于高积累品种IR34582和太粳558，而根F4分配比例却均显著低于高积累品种IR34582和太粳558；Cd胁迫下，根F2和F3中Cd分配比例无显著差异。

表3 不同水稻品种根中Cd亚细胞分布及其分配比例Table 3 Subcellular distribution of Cd in the roots of different rice cultivars

2.3 不同水稻品种茎中Cd亚细胞分布及其分配比例

不同水稻品种茎中Cd亚细胞分布及其分配比例如表4所示。Cd胁迫下，低积累品种茎F1、F2、F3和F4中Cd含量均显著低于高积累品种；茎中亚细胞组分Cd分配主要集中于F1和F4(大约75%以上)，Cd分配比例依次为F1﹥F4﹥F2﹥F3；低积累品种越冬稻和R1088茎F1分配比例均显著高于高积累品种IR34582和太粳558，而茎F4分配比例却均显著低于高积累品种IR34582和太粳558；Cd胁迫下，茎F2和F3中Cd分配比例无显著差异。

表4 不同水稻品种茎中Cd亚细胞分布及其分配比例Table 4 Subcellular distribution of Cd in the stems of different rice cultivars

图1 不同浓度Cd处理中水稻各组织间Cd转运效率注：不同小写字母表示在同一Cd浓度条件(5和25 mg·kg-1)下不同水稻品种各组织间转运效率在P<0.05上差异显著，TFR-S表示TF根-茎，TFS-B表示TF茎-糙米，TFLS-B表示TF叶鞘-糙米，TFL-B表示TF叶-糙米。Fig. 1 Cd transport efficiency among rice tissues under different levels of Cd concentrationNote: Different small letters mean the translocation efficiency of different rice varieties in the same concentration of Cd (5 and 25 mg·kg-1) showing significant difference between Cd treatments at 0.05 levels. TFR-S means TFroot-stem, TFS-B means TFstem-brown rice, TFLS-B means TFleaf sheath-brown rice, TFL-B means TFleaf -brown rice.

2.4 不同水稻品种叶鞘Cd亚细胞分布及其分配比例

不同水稻品种叶鞘Cd亚细胞分布及其分配比例如表5所示。Cd胁迫下，低积累品种叶鞘F1、F2、F3和F4中Cd含量均显著低于高积累品种；叶鞘亚细胞组分Cd分配主要集中于F1和F4(大约70%以上)，Cd分配比例依次为F1﹥F4﹥F2﹥F3；低积累品种叶鞘中F1、F2、F3和F4中Cd分配比例与高积累品种无显著差异。

表5 不同水稻品种叶鞘中Cd亚细胞分布及其分配比例Table 5 Subcellular distribution of Cd in the sheaths of different rice cultivars

2.5 不同水稻品种叶中Cd亚细胞分布及其分配比例

不同水稻品种叶中Cd亚细胞分布及其分配比例如表6所示。Cd胁迫下，低积累品种叶F1、F2、F3F3和F4中Cd含量均显著低于高积累品种；叶中亚细胞组分Cd分配主要集中于F1和F4(大约75%以上)，Cd分配比例依次为F1﹥F4﹥F2﹥F3；低积累品种叶中F1、F2、F3和F4中Cd分配比例与高积累品种无显著差异。

表6 不同水稻品种叶中Cd亚细胞分布及其分配比例Table 6 Subcellular distribution of Cd in the leaves of different rice cultivars

2.6 不同水稻品种各组织间转运效率与亚细胞分布比例的相关性分析

不同水稻品种各组织间转运效率与Cd亚细胞分布比例的相关性分析如表7所示。TF根-茎与细胞壁(F1)Cd分配比例相关性分析即为TF根-茎与根中细胞壁(F1)的Cd分配比例相关性分析。

在Cd5中，TF根-茎和TF茎-糙米均与F1分配比例成显著负相关，相关系数分别为-0.893和-0.974(P<0.01)，TF根-茎和TF茎-糙米均与F4分配比例成显著正相关，相关系数分别为0.869和0.979(P<0.01)；在Cd25中，TF根-茎和TF茎-糙米均与F1分配比例成显著负相关，相关系数分别为-0.852和-0.934(P<0.01)。TF根-茎和TF茎-糙米均与F4分配比例成显著正相关，相关系数分别为0.887和0.934(P<0.01)。

Cd胁迫下，根中F1、F4均与TF根-茎相关性显著；茎中F1、F4均与TF茎-糙米相关性显著；而叶鞘中F1、F4均与TF叶鞘-糙米相关性不显著；叶中F1、F4均与TF叶-糙米相关性不显著。

在Cd5中，TF根-茎与F2分配比例成显著正相关，相关系数为0.704(P<0.05)，TF根-茎与F3分配比例成显著正相关，相关系数为0.711(P<0.01)，而在Cd25中相关性不显著；在Cd5中，TF叶鞘-糙米与F4分配比例成显著正相关，相关系数为0.660(P<0.05)，而在Cd25中相关性不显著。

3 讨论(Discussion)

水稻不同器官对Cd的吸收能力存在很大差异，其中以根吸收富集Cd的能力最强，一般以根>茎叶>籽粒的顺序递减[25]。有研究表明，Cd胁迫下，不同Cd积累特性水稻根系Cd含量均显著高于地上部[26-27]。本研究与前人研究结果一致，Cd胁迫下，Cd大多数积累于根系部位，低积累品种可以积累80%以上的Cd，高积累品种可以积累60%以上的Cd。这说明根系的滞留作用是植物应对Cd胁迫的重要机制[28-29]。

表7 不同水稻品种各组织间转运效率与Cd亚细胞分布比例的相关系数(r)Table 7 Correlation coefficient (r) between the subcellular distribution ratios of Cd and translocation factors (TF) of Cd in rice

注：“*”代表相关性在P<0.05水平上显著；“**”代表相关性在P<0.01水平上显著。

Note: “*” significance atP<0.05; “**” significance atP<0.01.

根系对Cd的吸收转运、地上部对Cd的分配决定了籽粒Cd的积累。转运效率反映Cd在水稻组织中的转运能力，转运效率越大，其在组织间的转运能力就越强，对籽粒Cd积累的影响就越大[18]。有研究发现，高积累水稻品种根系、茎和叶Cd含量均高于低积累水稻品种[30]。本研究中，Cd胁迫下高积累水稻品种根系Cd含量显著低于低积累水稻品种，而地上部各部位Cd含量却均显著高于低积累水稻品种。这可能与不同水稻品种间本身的遗传特性相关[31-32]。已有研究表明，高积累品种根系往地上部转运Cd的效率高于低积累水稻品种[30,33]，本研究结果与前人的研究结果类似，低积累品种往地上部转运Cd的能力显著低于高积累品种，越冬稻和R1088转运效率TF根-茎只有10%左右，而IR3482和太粳558高达20%以上；同时，越冬稻和R1088地上部往糙米转运Cd的能力也均显著低于IR3482和太粳558。相比低积累品种，高积累品种更多地往地上部转运Cd是导致不同Cd积累特性的重要机理[34]。

在亚细胞水平上能深入研究水稻对Cd的吸收转运、积累和耐受机制[35]。细胞壁沉降Cd以及细胞内的区隔化作用是植物体内部钝化Cd的2个重要过程[36]，细胞壁是保护水稻免受Cd毒害的第一道屏障，其上的纤维、半纤维和果胶等物质能阻止Cd进入原生质层[37]，因此，不同水稻品种各组织亚细胞组分中，细胞壁的Cd含量及分配比例均最高。当少量Cd进入植物细胞原生质层后，只有少部分会以游离态的形式存在于细胞中，大部分会与一些小分子化合物以螯合态的形式存在于可溶部分中[38]，所以Cd大部分存在于细胞壁和可溶部分中[30,39]。目前，关于Cd在亚细胞中的分布仍存在争议，张路等[40]研究发现，Cd胁迫下，水稻材料中Cd的亚细胞分布表现为可溶部分>细胞壁>细胞器，而另有研究发现，Cd的亚细胞分布表现为细胞壁>可溶部分>细胞器[39]。本研究发现，在Cd胁迫下，不同基因型水稻同一品种各组织Cd亚细胞分配比例均表现为细胞壁>可溶部分>细胞膜、细胞器，对比高、低积累水稻品种间根和茎亚细胞组分Cd分配比例发现，越冬稻和R1088细胞壁分配比例均显著高于IR3482和太粳558；而越冬稻和R1088可溶部分分配比例却均显著低于IR3482和太粳558；在叶鞘和叶中，两者分配比例在不同品种之间无显著差异，这与Liu等[22]的研究结果一致。这些研究结果的差异可能是由于实验处理以及栽培品种的不同导致[40]，而高、低积累水稻品种间根和茎亚细胞组分Cd分配比例的不同，可能是导致它们从根部往地上部转运Cd以及从茎往糙米转运Cd的能力存在差异的直接原因。

亚细胞组分细胞壁在水稻Cd沉积中起主要作用，并抑制Cd从根到茎的转运[41]，可溶部分则是水稻将Cd转运到籽粒中主要的Cd亚细胞池[42]。本研究发现，高、低积累品种间，根与茎的细胞壁和可溶部分Cd分配比例存在较大差异。通过相关性分析发现，在Cd胁迫下，TF根-茎和TF茎-糙米与细胞壁中Cd分配比例均成显著负相关，而TF根-茎和TF茎-糙米与可溶部分分配比例均呈显著正相关。由此可以推知，根和茎中细胞壁和可溶部分Cd的亚细胞分布是影响Cd从根部转运到地上部以及茎到籽粒的重要因素。一定浓度Cd胁迫下(Cd5时)，TF根-茎与根中细胞器和细胞膜分配比例存在显著相关性，而在Cd25时相关性不显著，TF叶鞘-糙米与可溶部分分配比例也存在相同关系，这可能因为Cd超过一定范围后打破了植物对Cd的耐受机制[43]，影响了Cd在水稻中的吸收转运所致。

不同水稻品种对Cd的吸收、转运和分配存在差异，不仅仅是亚细胞组分Cd分配比例不同所致。有研究发现，非蛋白巯基(NPT)和谷胱甘肽(GSH)是影响Cd迁移的重要物质[9]，水稻OsHMA2等基因编码的阳离子转运蛋白能够携带Cd2+从根系向地上部运输[44]，水稻在成熟过程中，OsPCR1与Cd向籽粒的运输密切相关[45]，其具体生理、分子机理有待进一步研究。

本文得出的主要结论如下：

(1)在不同水稻品种中，Cd大部分积累于水稻根系中；低积累品种根系Cd含量高于高积累品种，而地上部各组织部位Cd含量均低于高积累品种；高积累品种往地上部转运Cd的能力更强。

(2)不同基因型水稻品种各组织部位Cd的亚细胞分布存在差异，低积累品种根和茎中细胞壁Cd分配比例高于高积累品种，而可溶部分Cd分配比例却低于高积累品种。这说明细胞壁和可溶部分在Cd迁移过程中起着重要作用。

(3)在高、低积累品种中，TF根-茎和TF茎-糙米均与细胞壁Cd分配比例成显著负相关关系，而与可溶部分成显著正相关关系。这说明细胞壁具有较强的Cd固持能力，是限制Cd迁移的重要物质；而Cd的迁移是伴随可溶部分一同进行，可溶部分Cd分配比例越高，Cd迁移能力越强。

致谢：感谢四川农业大学水稻研究所李健博士在实验中提供的帮助。