陈怡雪，牛闪闪，李红萍，于 斐，吴拥军，刘利娥*

1. 郑州大学公共卫生学院，河南 郑州 450001 2. 郑州大学化工与能源学院，河南 郑州 450001

引 言

DNMT1是人体内含量最多、最重要的甲基转移酶，它是以病灶为靶点负责将亲代DNA甲基化信息遗传至子代细胞，是维持DNA甲基化遗传稳定性的关键酶[1]。研究表明，其表达水平和活性变化与胃肠癌、肺癌、食管癌等多种肿瘤的发病机制密切相关，是癌症发生发展重要的分子标志[2-4]。目前，DNMTs的检测方法有很多，如比色法[5]，高效液相色谱法[6]，化学发光分析法[7]及电化学分析法[8]等。但这些方法大多是以原核细胞的甲基化转移酶如DNA adenine methylation (Dam) MTase，M.SssI为测量对象，只有少数着眼于人类基因的DNMT1，并局限于实验室研究，未应用于实际样品的检测。因此，建立一种快速、灵敏度高的DNMT1定量新方法具有重要的癌症早筛及临床应用价值。

荧光免疫分析法具备荧光法灵敏度高、线性范围宽、选择性良好等优点的同时，还具备免疫法的高特异性，在许多领域中应用广泛。磁性Fe3O4纳米颗粒是将高分子材料与无机Fe3O4粒子结合起来的一种复合微球，比表面积大，能够提供更多空间使抗原抗体充分结合，同时兼具良好的生物相容性与磁分离性能，通常在生物样品混合物的分离中被用作载体。

本研究用Fe3O4磁性纳米球代替聚苯乙烯板作为固相载体，负载DNMT1单克隆抗体作为捕获探针，捕获并富集复杂基质中的目标物。磁分离具有分离速度快、不影响待测物的活性，能够简化操作流程并减少复杂样品中基质对测定的干扰[9]。在此基础上，捕获探针与抗原及荧光检测探针形成“三明治”夹心结构，建立荧光免疫分析法，并将其用于血清样品中DNMT1含量的高灵敏检测。

1 实验部分

1.1 试剂及仪器

DNMT1抗原(OriGene公司)； DNMT1小鼠单克隆抗体(McAbDNMT1，abcam公司)； DNMT1兔多克隆抗体(PcAbDNMT1，abcam公司)； 5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯荧光染料(5-TAMRA，淄博昀辉生物化工技术有限公司)； DNMT1商品化ELISA试剂盒(武汉云克隆科技有限公司)； 羧基化磁性Fe3O4纳米球(50 mg·mL-1，百运纳米科技有限公司)； N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(Sulfo-NHS，分析纯，阿拉丁公司)； 碳二亚胺盐酸盐(EDC，分析纯，阿拉丁公司)； Millipore超纯水(18.2 MΩ·cm)； PBS磷酸盐缓冲液(0.01 mol·L-1，pH 7.4)； PBST缓冲液(0.05%Tween20)。

纳米粒度及Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano-zs 90，英国Malvern)，红外光谱仪(PE-1710，德国PE)，荧光分光光度计(F-4500，日本日立)，紫外-可见分光光度计(UV-1601，日本岛津)，磁分离板(百运纳米科技有限公司)。

1.2 磁性Fe3O4免疫捕获探针的制备

取100 μL Fe3O4溶液，磁分离，用PBS清洗3次； 加入100 μL McAbDNMT1(0.1 mg·mL-1)混匀，分别加入100 μL Sulfo-NHS和EDC，涡旋20 min，于25 ℃偶联2 h； 磁分离，取上清用于计算偶联效率，用PBS清洗2次。加入300 μL PBS(含0.5%BSA)震荡30 min封闭未活化基团，分散于300 μL PBS中，4 ℃保存。

1.3 免疫荧光检测探针的制备

取100 μL PcAbDNMT1(0.25 mg·mL-1)于装有1.0 mL PBS的离心管中，混匀后加入5.0 μL 5-TAMRA稀释液(27.4 nmol)，涡旋3 h偶联。取400 μL偶联物于预冷的超滤管(30KDa)中离心，最后将超滤管倒置于离心管中，离心回收检测探针。

1.4 建立检测DNMT1的FLISA方法

在黑色96孔板中加入300 μL封闭液，37 ℃温育90 min后用PBST洗板3次； 每孔加入Fe3O4@McAbDNMT1稀释液100 μL(1∶40)，磁分离后PBST洗3次。加入100 μL 0.05，0.1，0.25，0.5，1，5，10，20，40和80 ng·mL-1DNMT1抗原，37 ℃温育90 min，PBST洗板3次。加入100 μL 稀释20倍的5-TAMRA@PcAbDNMT1溶液，37 ℃温育90 min，PBST洗板5次。加入200 μL PBST，测定96孔板中各孔的相对荧光强度(RFU)，以浓度为横坐标，检测信号为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5 建立ELISA与MELISA方法

在参考文献[10]的基础上分别建立检测DNMT1的ELISA方法和MELISA方法。

1.6 方法学评价

精密度： 取一块96孔板，分别配制低、中、高浓度的样品，每个水平平行6份，按照1.4节的方法进行实验，根据测定结果计算板内精密度； 同上，取不同的96孔板，计算板间精密度。

准确度： 配制三个浓度的DNMT1标准品，按照1.4节中步骤进行测定，将所得结果与加标浓度进行比较，计算方法准确度。

特异性： 选取与DNMT1性质相似的DNA甲基转移酶DNMT3a和DNMT3b为检测对象，在与测DNMT1相同的条件下测定RFU，考察方法的特异性。

方法学比较： 用所建立的FLISA检测DNMT1含量，并与MELISA和ELISA进行比较。

1.7 样品分析

血清样本来自郑州大学第一附属医院呼吸与重症科室。取15例肺癌患者的血清样品，用FLISA方法检测DNMT1含量，并将检测结果与商品化ELISA试剂盒进行比较。

2 结果与讨论

2.1 FLISA检测DNMT1的实验原理

FLISA测定DNMT1的原理见图1。采用EDC/Sulfo-NHS键合法，羧基功能化的Fe3O4磁珠为固相载体，与McAbDNMT1偶联制备免疫捕获探针，加入DNMT1标准品或待测样品，待测目标物被探针捕获并富集，磁分离后加入标记有荧光检测探针5-TAMRA@PcAbDNMT1，此时形成双抗体夹心的“三明治”结构，磁分离。用200 μL PBST对磁性复合物进行悬浮，于555 nm激发光照射下检测580 nm处的荧光强度，根据荧光强度和目标物浓度的关系进行定量分析。

图1 FLISA法检测DNMT1原理

2.2 Fe3O4@McAbDNMT1的表征

2.2.1 Fe3O4@McAbDNMT1的红外光谱

按照1.2节中实验方法测定偶联效率，Fe3O4和McAbDNMT1的偶联效率为76.3%。

图2 Fe3O4@McAbDNMT1和Fe3O4红外吸收光谱

2.2.2 Fe3O4@McAbDNMT1的Zeta电位

捕获探针的Zeta电位分析结果见图3(a)。从图3(a)数据可以看出，羧基化的Fe3O4的Zeta电位-10.8 mV，Fe3O4@McAbDNMT1的Zeta电位-8.45 mV，McAbDNMT1的Zeta电位-4.47 mV，羧基Fe3O4与抗体偶联引起电位发生变化，提示McAbDNMT1成功偶联到Fe3O4上。

图3 偶联物的Zeta电位

2.2.3 Fe3O4@McAbDNMT1免疫活性

用ELISA检测Fe3O4@McAbDNMT1的免疫活性的实验结果见图4。图中显示Fe3O4@McAbDNMT1稀释比相同的情况下，随着抗原浓度的增加吸光度逐渐增大； 在抗原浓度相同的情况下，随着Fe3O4@McAbDNMT1稀释比的增大吸光度逐渐减小，表明在羧基化Fe3O4表面成功修饰了McAbDNMT1，并保持了抗体的活性。

图4 Fe3O4@McAbDNMT1的免疫活性

2.3 5-TAMRA@PcAbDNMT1的表征

2.3.1 5-TAMRA@PcAbDNMT1的紫外-可见吸收光谱

分别绘制5-TAMRA，PcAbDNMT1及5-TAMRA@PcAbDNMT1的紫外-可见吸收光谱，如图5所示。从图5中可以看出，5-TAMRA的最大吸收峰为551 nm，PcAbDNMT1在280 nm处有最大吸收峰，5-TAMRA@PcAbDNMT1在280 nm处和在555 nm均有吸收峰，表明偶联成功。

图5 5-TAMRA@PcAbDNMT1的紫外-可见吸收光谱

2.3.2 5-TAMRA@PcAbDNMT1的Zeta电位

检测探针的Zeta电位测量结果见图3(b)。从图3(b)可以看出，5-TAMRA，PcAbDNMT1和5-TAMRA@PcAbDNMT1的Zeta电位分别为-1.950，1.320和-0.968 mV。5-TAMRA与抗体偶联后形成了偶联物导致Zeta电位发生变化，提示PcAbDNMT1与5-TAMRA偶联成功。

2.3.3 5-TAMRA@PcAbDNMT1的激发光谱与发射光谱

5-TAMRA@PcAbDNMT1的激发光谱与发射光谱分别见图6(a)和(b)。由图6(a)可知，5-TAMRA及其偶联物的最大激发波长为555 nm。由于5-TAMRA在偶联的过程中有损失，所以偶联物的荧光强度与5-TAMRA相比有所减弱。由图6(b)可知，5-TAMRA的最大发射波长是575 nm，而偶联物的最大发射波长为580 nm，发生了红移，表明5-TAMRA与PcAbDNMT1生成了新的偶联产物。

图6 (a) 5-TAMRA@PcAbDNMT1的激发光谱;(b) 5-TAMRA@PcAbDNMT1的发射光谱

2.3.4 5-TAMRA@PcAbDNMT1的免疫活性

利用抗原抗体的特异性结合进行免疫活性分析，结果见图7，随着抗原浓度的逐渐增加，荧光强度随之增大，表明5-TAMRA与PcAbDNMT1形成了偶联物，并保持了抗体的免疫活性。

图7 5-TAMRA@PcAbDNMT1的免疫活性

2.4 方法学的评价与比较

2.4.1 FLISA标准曲线

方法的标准曲线如图8所示。

图8 DNMT1的标准曲线

2.4.2 FLISA检出限、精密度、准确度及方法学比较

FLISA，MELISA和ELISA检测DNMT1的方法学见表1、所需时间见表2。从表1数据可以看出，FLISA方法的检出限最低，板内与板间精密度好、准确度符合要求。表2数据显示，不同分析方法所需分析时间从短到长的顺序为： FLISA

表1 三种分析方法的线性范围、相关系数和检出限

表2 三种分析方法的反应时间

2.4.3 特异性评价

特异性分析结果见图9。图9显示： 在DNMT1，DNMT3a和DNMT 3b浓度相同时，测定DNMT3b的信号值约为DNMT1的1/7，DNMT3a的信号值更低，方法的特异性良好。

图9 FLISA方法检测DNMTs的特异性

2.4 样品分析

分别用FLISA和商品化ELISA试剂盒检测了15例人血清中DNMT1含量，并用配对t检验对两种分析方法的测定结果进行了相关分析(t=1.906，p>0.05)，差异无统计学意义。相关性分析结果见图10所示，说明所建立的FLISA法可以用于检测人血清样品中DNMT1的含量。

图10 FLISA与ELISA测定结果的相关性分析

3 结 论

以比表面积大的Fe3O4纳米颗粒为固相载体固定DNMT1单克隆抗体，克服了常规ELISA分析中包被的抗原(或抗体)易脱落，固液接触面积小，反应速度慢，分析时间长等不足； 结合纳米技术、磁分离技术以及免疫分析技术，建立基于免疫磁性纳米颗粒的荧光免疫分析(FLISA)法，用于人血清中DNMT1含量分析。与ELISA和MELISA法比较，FLISA法检出限低，灵敏度高，特异性强，操作简单，有望应用于高通量、大样本的检测，可考虑进一步制成试剂盒，提高检测效率。