王 磊，张富春，刘 军

（新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830046）

食管癌是消化道最常见的恶性胃肠道肿瘤[1]，作为全球第六大癌症死亡原因，每年约51万 人因食管癌死亡，57万食管癌病例被确诊[2-4]。食管癌肿瘤发病率居我国恶性肿瘤发病率的第3位，死亡率居我国恶性肿瘤死亡率的第4位[5]。现代外科手术结合不同治疗策略取得了一定的疗效，如放疗、化疗以及免疫治疗[6]，但近5 年食管癌患者生存率仍小于20%[3]。此外，现有抗肿瘤化学药物存在价格昂贵、副作用大等弊端，因此必须寻找及开发新型有效的抗肿瘤活性药物。饮食与癌症化学预防已备受关注，如大蒜被广泛应用于食品和调味剂，而大蒜素可作为抗癌药物[7]。有研究表明食物的生物活性物质与降低癌症风险有着密切的关系[8]。

阿魏菇（Pleurotus ferulae）属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳属，又名阿魏侧耳，是一种大型肉质伞菌，因寄生或腐生在干旱草原一种药用植物阿魏上而得名，是新疆特有的一种药食同源菌类[9]，具有抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力、降血脂等多种功能[10-12]。这些功能普遍被认为与阿魏菇中存在的大量活性物质有关[10-11,13]；目前对其水提物中主要活性物成分多糖的研究较多[14]，而对其醇提物中活性成分的研究却鲜见报道。本课题组前期研究表明，阿魏菇醇提物中含有的主要活性成分是三萜类、生物碱以及皂苷类[15]。国内外的研究表明，三萜类化合物在抗癌方面具有较高的研究价值[16-22]，例如灵芝三萜类被报道具有良好的抗肿瘤作用[22]，萜类化合物CDDO-Im作为抗肿瘤药物已进入临床实验阶段[23]。因此，本实验以前期优化后的阿魏菇粗三萜（Pleurotus ferulatus triterpenoid，PFTP）提取条件进行提取并分级萃取[9]，研究阿魏菇乙酸乙酯相三萜类化合物（ethyl acetate phase of PFTP，PFTP-E）对Eca109细胞的抗肿瘤作用机制，以期为食管癌的治疗提供植物源的天然抗肿瘤候选药物。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阿魏菇由新疆南山栽培基地提供，由新疆大学生命科学与技术学院逯永满老师鉴定。人食管癌细胞Eca109、人胃癌细胞BGC823、人结肠癌细胞HT29、人结肠癌细胞SW480、人结肠癌细胞HCT116、小鼠结肠癌细胞CT26由新疆大学生物资源与基因工程重点实验室和欧易生物医学科技有限公司提供。

β-actin、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）3、Caspase9、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）、Bcl2、Bax、细胞色素c（cytochrome c，Cyt c）、真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）、p-eIF2α、CHOP、Cyclin B1、细胞外信号相关激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、p-ERK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p-JNK、p38、p-p38、LC3 A/B抗体、二抗山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、山羊抗兔IgG 上海生工生物工程公司；3-(4,5-二甲基噻-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT） 北京索莱宝生物科技公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美国Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、0.25%胰蛋白酶、青霉素、链霉素 美国HyClone公司；细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒上海翊圣生物科技公司；Hoechst 33258染液、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒 上海碧云天生物工程公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒、电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）显色试剂盒美国赛默飞世尔公司。

1.2 仪器与设备

DK8D型电热恒温水浴锅 广州沪瑞明仪器有限公司；2200.2超声波破碎仪 北京桑翌实验仪器研究所；RE-1050旋转蒸发仪 河南兰帆实业有限公司；LGJ-10真空冷冻干燥机 北京松源华兴生物技术有限公司；Heracell-150i细胞培养箱 美国赛默飞世尔公司；LSR Fortessa X-20流式细胞仪 美国BD公司；CMax-Plus酶标仪 北京华泰和合商贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 阿魏菇三萜类化合物的制备

新鲜阿魏菇子实体清洗干净切片，真空冷冻干燥处理，粉碎过40 目筛包装保存。称取阿魏菇冻干粉100 g，加入2 L体积分数95%乙醇溶液，混匀后50 ℃超声40 min，75 ℃水浴25 min，过滤收集上清液，提取3 次，合并滤液，浓缩至100 mL后得PFTP。将浓缩后的PFTP依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取3 次，每次30 min，将3 个萃取相浓缩、冷冻干燥，得浸膏石油醚相提取物（PFTP-P）、乙酸乙酯相提取物（PFTP-E）、正丁醇相提取物（PFTP-B）。PFTP用DMSO溶解，贮存质量浓度为150 mg/mL，PFTP-P、PFTP-E、PFTP-B用DMSO溶解，贮存质量浓度均为50 mg/mL。

1.3.2 细胞培养

细胞培养于含质量分数10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM和RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2、相对湿度95%的无菌培养箱中培养，每2～3 d换液传代1 次，取接种于培养板24 h后的细胞进行实验。

1.3.3 MTT法检测细胞增殖能力

分别取对数期的Eca109、BGC823、HT29、SW480、HCT116和CT26细胞，胰蛋白酶消化，取100 μL细胞悬液（5×103个/孔）接种于96 孔板，培养24 h，PFTP、PFTP-P、PFTP-E、PFTP-B分别于37 ℃处理肿瘤细胞24、48、72 h，移除培养基，加入100 μL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）稀释的0.5 mg/mL MTT溶液，孵育3 h，移除MTT溶液，加入200 μL DMSO，振荡至结晶充分溶解，酶标仪检测490 nm波长处吸光度，以正常生长细胞为对照，重复3 次后按下式计算细胞存活率，从而得到半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.4 Hoechst 33258染色观察细胞凋亡

取培养至对数期的Eca109细胞接种于96 孔细胞培养板（1×104个/孔），培养24 h，PFTP-E处理24 h，以正常生长细胞为空白对照，以顺铂（35 μg/mL，下同）处理组为阳性对照，以DMSO（与PFTP-E等体积，下同）处理组为阴性对照。移除培养液，体积分数4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS清洗2 次，移除PBS，加入30 μL Hoechst 33258避光染色10 min，荧光倒置显微镜下观察拍照。

1.3.5 流式细胞术分析细胞凋亡、周期、胞内ROS水平和线粒体膜电位

取培养至对数期的Eca109细胞接种于60 mm细胞培养板（2.5×105个/孔），培养24 h，PFTP、PFTP-E处理24 h，以正常生长细胞为空白对照，以顺铂处理组为阳性对照，以DMSO处理组为阴性对照。移除培养液，胰蛋白酶消化，收集细胞，冷PBS洗2 次。然后采用Annexin VFITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）双标记染色法流式细胞术检测细胞凋亡；采用PI单标记法流式细胞术检测细胞周期；采用荧光探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐（2',7'-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）标记法流式细胞术检测胞内ROS水平；采用荧光探针JC-1标记法流式细胞术检测线粒体膜电位。用Flowjo 7.6软件处理数据。

1.3.6 Western blot法检测相关蛋白表达量

取培养至对数期的Eca109细胞接种于60 mm细胞培养板（2.5×105个/孔），培养24 h，PFTP、PFTP-E处理24 h，以DMSO处理组为阴性对照。移除培养液，胰蛋白酶消化后收集细胞，冷PBS洗2 次，RIPA溶液（15 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、质量分数1% Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、1 mmol/L Na3VO4、10 μg/mL蛋白酶抑制剂和10 μg/mL亮抑肽酶，pH 7.4）冰上裂解提取总蛋白，BCA法测定蛋白质量浓度，各组蛋白上样量相同，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），转至聚偏氟乙烯膜，用含质量分数5%脱脂奶粉的PBST溶液37 ℃封闭1 h。37 ℃一抗（β-actin、Caspase3、Caspase9、PARP、Bcl2、Bax、Cyt c、eIF2α、p-eIF2α、CHOP、Cyclin B1、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、LC3 A/B抗体）孵育2 h（体积比1∶200～1∶1 000），PBST洗3 次；37 ℃二抗（山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG）孵育1 h（1∶2 000），PBST洗3 次，用ECL试剂盒显色。

1.4 数据统计与分析

实验数据采用 ±s表示，利用GraphPad Prism 5.0软件进行单因素方差分析以及t检验并作图，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 PFTP对肿瘤细胞的增殖抑制作用

以齐墩果酸标准品绘制的标准曲线y＝3.742 4x+0.078 9计算得到PFTP的三萜质量分数为2.6%。如表1所示，PFTP对6 种细胞的生长均具有抑制作用。随着作用时间延长，PFTP对6 种细胞的增殖抑制能力均逐渐增强，表现出时间依赖性。PFTP对Eca109和CT26细胞抑制作用最强，在24 h对BGC823细胞无明显抑制作用。Eca109为人源肿瘤细胞，而CT26属于鼠源肿瘤细胞，因此本研究选用Eca109细胞系进行后续生物学分析。

表1 PFTP对肿瘤细胞的IC50Table 1 IC50 of PFTP againsttumor cells

2.2 PFTP对Eca109细胞凋亡的影响

图1 PFTP对Eca109细胞凋亡和坏死的影响Fig. 1 PFTP promoted apoptosis and necrosis of Eca109 cells

1.6 mg/mL PFTP处理Eca109细胞24 h后，与空白对照和阴性对照组相比，阳性对照和PFTP组Eca109细胞凋亡率（PI和FITC双阳区及FITC单阳区）和坏死率（PI单阳区）存在极显著差异，说明PFTP可诱导Eca109细胞凋亡和坏死（图1）。图1B显示PFTP诱导细胞凋亡的能力明显弱于顺铂，但引起细胞坏死的能力强于顺铂。这种差异很可能由于PFTP成分复杂，主成分不单一，造成细胞不同程度的损伤，引起细胞坏死程度较高，但诱导细胞凋亡活性成分含量低，诱导细胞凋亡能力弱于顺铂，因此对PFTP作进一步分离提纯。

2.3 PFTP各萃取相对Eca109细胞增殖的影响

以齐墩果酸标准品绘制的标准曲线y＝3.742 4x+0.078 9计算得到PFTP不同萃取相中三萜质量分数由高到低分别为PFTP-E（21.59%）、PFTP-P（14.22%）、PFTP-B（10.36%）。PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B对Eca109细胞的增殖抑制能力比萃取前的PFTP有明显提高（图2）。PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B在处理24、48、72 h对Eca109细胞的IC50分别为201.5、401.3、587.2 μg/mL，151.3、251.5、351.6 μg/mL和70.0、214.6、274.2 μg/mL，且处理时间越长IC50越小；相同处理时间下PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B对Eca109细胞的IC50逐渐增大，表明PFTP各萃取相以时间和剂量依赖形式杀伤肿瘤细胞，PFTP-E对Eca109细胞的增殖抑制能力最强。由图2E可知，PFTP-E质量浓度在400 μg/mL内对正常小鼠脾脏细胞处理24 h无毒副作用。如图2D所示，400 μg/mL PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B细胞增殖抑制能力与三萜含量具有正向剂量-效应关系，初步猜测三萜类为PFTP中主要的抗肿瘤活性物质。因此用PFTP-E处理Eca109细胞24 h做进一步分析。

图2 PFTP各萃取相对Eca109细胞增殖的影响Fig. 2 Effect of different solvent fractions of PFTP on proliferation of Eca109 cells

2.4 PFTP-E对Eca109细胞周期的阻滞作用

图3 PFTP-E对Eca109细胞周期的影响Fig. 3 Effect of PFTP-E on cell cycle of Eca109 cells

如图3A、B所示，PFTP-E可有效地将Eca109细胞周期阻滞在G2/M期，且质量浓度越大阻滞效果越明显，G2/M期的细胞比例由PFTP-E 100 μg/mL的6.02%增加至300 μg/mL的18.68%。表明PFTP-E可将Eca109细胞周期阻滞在G2/M期，并具有浓度依赖性。Western blot结果显示，PFTP-E可高度显著下调G2期向M期转换的关键周期蛋白Cyclin B1表达（图3C、D），将细胞周期阻滞在G2/M期。

2.5 PFTP-E对Eca109细胞凋亡的影响

图4 PFTP-E对Eca109细胞凋亡的影响Fig. 4 Effect of PFTP-E on apoptosis of Eca109 cells

PFTP-E将Eca109细胞周期阻滞于G2/M期，导致细胞不能进行正常增殖，因此进一步检测其是否会导致细胞凋亡。图4A显示PFTP-E通过诱导Eca109细胞凋亡而抑制其生长。图4B显示PFTP-E处理24 h后细胞凋亡率与空白对照组相比呈显著性差异，并在质量浓度为400 μg/mL时达到80%。图4C显示PFTP-E引起细胞毒性的原因为诱导细胞凋亡，这与PFTP诱导细胞坏死的结果存在差异。

细胞凋亡典型特征是细胞变圆、贴壁能力降低、内部染色质断裂固缩、DNA片段化断裂、细胞膜外翻等。通过Hoechst染色观察核形态变化，由图4D可观察到，随着PFTP-E质量浓度的增加（100～300 μg/mL），细胞数量相比于空白对照组明显减少；空白对照组细胞为均匀蓝色细胞核，PFTP-E处理组细胞核因高度固缩呈高亮蓝白色（箭头），具有显著的浓度效应。综合上述结果可以说明PFTP-E通过诱导Eca109细胞凋亡而抑制其生长。

2.6 PFTP-E对Eca109细胞线粒体膜电位的影响

线粒体作为细胞的能量工厂，对细胞存活、生长、增殖、分化具有重要的作用。一些作为抗肿瘤药物的植物次生代谢物通常会激活凋亡途径中经典的线粒体途径[24]。图5A显示，PFTP-E以浓度依赖性的方式增加FITC绿色荧光强度（细胞门内），相比于空白对照组，PFTP-E质量浓度大于200 μg/mL时可极显著增加JC-1单体荧光强度（图5B），降低线粒体膜电位，导致线粒体膜电位崩溃。说明PFTP-E可能通过线粒体途径诱导Eca109细胞凋亡。

图5 PFTP-E对Eca109细胞线粒体膜电位的影响Fig. 5 Effect of PFTP-E on mitochondrial membrane potential of Eca109 cells

2.7 PFTP-E对Eca109细胞胞内ROS水平的影响

由图6A可知，PFTP-E处理组荧光峰向右偏移。图6B显示与空白对照相比，PFTP-E处理组DCF相对荧光强度显著增加（表现为处理组峰发生偏移），表明PFTP-E以浓度依赖性显著诱导Eca109细胞胞内ROS产生。线粒体是ROS产生的主要细胞器，线粒体膜电位的降低致使线粒体膜通透性增加，导致ROS释放到细胞质，从而诱导细胞凋亡[25]。因此推测PFTP-E可能引起癌细胞线粒体损伤，导致大量ROS释放到胞质造成细胞损伤，使细胞增殖受到抑制，从而引起细胞凋亡。

图6 PFTP-E对 Eca109细胞胞内ROS的影响Fig. 6 Effect of PFTP-E on intracellular ROS level of Eca109 cells

2.8 PFTP-E对Eca109细胞凋亡相关因子表达量的影响

图7 PFTP-E对Eca109细胞凋亡相关因子表达量的影响Fig. 7 Effect of PFTP-E on the expression of apoptosis-related factors in Eca109 cells

为进一步证实PFTP-E能够诱导Eca109细胞凋亡，通过Western blot法检测胞质中的Cyt c以及凋亡相关蛋白分子Bcl2、Bax、PARP/剪切型PARP、Caspase3/剪切型Caspase3、Caspase9/剪切型Caspase9的表达变化，以及内质网应激相关蛋白eIF2α、CHOP和自噬标志物LC3 A/B的表达情况。如图7A所示，与阴性对照组相比，PFTP-E可以增强Cyt c、促凋亡蛋白Bax的表达，并降低Bcl2蛋白的表达，且在300 μg/mL时显著增强剪切型Caspase9、Caspase3、PARP的表达，激活经典的线粒体凋亡途径。同时，PFTP-E处理也显著提高了p-eIF2α、CHOP、LC3 A/B的表达（图7B），可能引起内质网应激并进一步诱导细胞自噬的发生。丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信号通路可通过磷酸化来调节细胞增殖、细胞凋亡及迁移，是最常见的癌症解除管制的信号途径之一[26]。图7C表明不同质量浓度PFTP-E处理Eca109细胞后可显著提高p-JNK表达水平，表明PFTP-E可能通过影响MAPK/JNK信号通路来调控Eca109的细胞凋亡。

3 讨 论

阿魏菇作为一种新疆特有药食同源菌类，具有很高的营养和药用价值。随着研究的深入，发现阿魏菇醇提物主要活性成分为三萜类、生物碱类、皂苷类等化合物[15]。三萜类物质是一类重要的中药化学成分，是药用真菌的主要活性成分之一[16]。近几年，对三萜类及其衍生物的抗肿瘤活性及其作用机制的研究成果迅速增加，大量研究表明三萜类化合物可以阻止肿瘤的发生，抑制癌细胞增殖、扩散、血管生成，诱导细胞凋亡分化和细胞周期阻滞，并促进化学增敏作用[27-28]。Sun Haiyan等报道从中草药升麻中提取的环烷三萜ADCX可抑制P-gp高表达的多抗药性细胞株HepG2/ADM增殖，并能通过抑制自噬降解进而促进其凋亡[18]。Zhao Yueliang也证实从泽泻根中提取分离的泽泻醋酸酯AB23A可以通过激活JNK途径和抑制ROS的积累来诱导结肠癌SW480、HCT116细胞的自噬依赖性凋亡，且不影响正常结肠细胞CC4-841CON生长[19]。Chen Suyu等研究表明三萜类化合物可通过激活凋亡相关的分子PARP、Caspase3/9等来促进细胞凋亡[29]。基于三萜类显著的抗肿瘤活性，为更好地开发利用阿魏菇资源，本研究制备了PFTP三萜（质量分数为2.6%），经萃取后的PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B三萜质量分数均具有较高程度的提高，分别为21.59%、14.22%、10.36%。MTT检测结果显示PFTP各萃取相均表现为时间和剂量依赖性地抑制Eca109细胞增殖，且抑制细胞增殖能力强弱顺序均为PFTP-E＞PFTP-P＞PFTP-B，这与各相中三萜质量分数相对应，即抑制细胞增殖活性与三萜质量分数具有正向的剂量-效应关系，初步推测阿魏菇抗肿瘤活性物质可能为三萜类。

探讨PFTP-E的抗肿瘤作用发现，PFTP-E对Eca109细胞处理24 h后的IC50由6.212 mg/mL降低至201.5 μg/mL，大幅提升抑制细胞增殖的能力。PFTP-E可将Eca109细胞周期阻滞在G2/M期而抑制细胞增殖，并降低细胞周期蛋白Cyclin B1的表达；且PFTP-E可导致Eca109细胞线粒体膜电位崩溃并激起胞内ROS水平显著升高，表明PFTP-E可能通过线粒体途径诱导Eca109细胞凋亡。进一步检测凋亡相关分子的表达发现，PFTP-E处理后Cyt c表达量显著升高，促凋亡因子Bax表达量增加，Bcl2表达量显著降低，同时其能够显著增加剪切型PARP、Caspase3以及Caspase9的表达，表明PFTP-E可促进线粒体凋亡分子的表达，激活Caspase蛋白酶家族，从而抑制Eca109细胞生长，即PFTP-E通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。据报道，三萜类化合物为多靶向性杀伤肿瘤细胞的一类化合物，内质网应激引发细胞凋亡为其机制之一[16]。内质网是主要负责蛋白质合成、折叠、转录后修饰以及转运的细胞器，GRP78是定位于内质网腔的一种维持胞内稳态的关键蛋白，内质网稳态时，GRP78结合蛋白激酶R样内质网激酶（proteinkinaser-like ER kinase，PERK）并导致其失活；内质网应激时，PERK会从GRP78上释放。PERK在内质网应激中的主要作用是抑制mRNA翻译，减少错误蛋白质合成，引起eIF2α快速地磷酸化，抑制蛋白质合成，减轻内质网负担。内质网功能持续紊乱将诱导CHOP的表达上调，CHOP作为调节内质网应激诱发的细胞凋亡蛋白可介导细胞程序性死亡。内质网应激已被证明是有效的自噬发生诱导条件，eIF2α通过磷酸化可激活自噬[30-32]。由图7可知，PFTP-E可显著上调p-eIF2α、CHOP和自噬标志物LC3 A/B的表达。综上可知，PFTP-E可能通过激活经典线粒体途径、细胞周期阻滞、内质网应激以及自噬而最终导致的凋亡（图8）。MAPK在抗肿瘤治疗中起重要作用，激活的MAPK可转换细胞外来刺激信号以调节细胞凋亡、增殖和生长。MAPK包括ERK、JNK和p38。JNK是MAPK家族的一种压力激活蛋白激酶，响应被激活的压力信号，其中上游的MAP激酶激酶7可以通过磷酸化来调节JNK的激活，激活的JNK能够调节很多转录因子，如AFT-2、c-Jun、AP-1和p53，它们能够被磷酸化并作为转录因子去转录激活目标基因，引发一系列胞内程序，如细胞增殖、凋亡、自噬及DNA修复[33-34]，图7C显示PFTP-E可浓度依赖性地增加p-JNK的表达，因此其可能通过激活MAPK/JNK信号通路促进Eca109细胞凋亡。

图8 PFTP-E诱导细胞凋亡相关途径Fig. 8 PFTP-E induces apoptosis-related pathways

PFTP-E能够上调促凋亡相关因子、下调抑凋亡相关因子的表达，表现出显著的促细胞凋亡作用，其促凋亡机制涉及MAPK/JNK信号通路，并与线粒体损伤途径、细胞周期阻滞、内质网应激及自噬有关（图8）。可以推测PFTP-E可通过诱导肿瘤细胞凋亡进而达到治疗癌症的作用，随着对阿魏菇三萜类物质不断的深入研究，开发阿魏菇三萜类组分作为新型抗癌药物具有广阔前景。