刘 玲，李奇璋，周选围，王玉亮

（上海交通大学农业与生物学院，上海 200240）

黑芝（Ganoderma atrum）属于担子菌亚门（Basidiomycota）层菌纲（Agaricomycetes）非褶菌目（Agaricomycetes）灵芝科（Ganodermataceae）真菌[1]。明朝的李时珍在《本草纲目》中记载并列举了“青芝、赤芝、白芝、黄芝、黑芝、紫芝”6 种灵芝的药用性能[2]。黑芝作为灵芝的一种，具有抗肿瘤[3-5]、抗氧化[6]、调节免疫[7-8]和抑菌[9]的功效。目前，对黑灵芝中的多糖[9-11]、灵芝酸[12-13]等活性成分的研究较深入，但对其生物活性蛋白功能的研究很少[3,14]。灵芝中的活性蛋白包括真菌免疫调节蛋白（fungal immunomodulatory protein，FIP）、凝集素、糖蛋白和酶等[15]。FIPs蛋白家族具有凝集血红细胞[16]、刺激人外周血淋巴细胞[17]和小鼠脾细胞增殖[18]、促进细胞因子表达、增加细胞介素转导[19]和抗肿瘤[20-22]等活性。

M1型巨噬细胞在肿瘤免疫治疗中发挥重要的作用[23]。巨噬细胞的激活通常由多种机制介导，包括暴露于干扰素和白细胞介素（interleukin，IL）-2等细胞因子，或者接触细菌、细菌产物和颗粒等[24]。巨噬细胞经典活化M1型表现为细胞增大、细胞质扩散、一氧化氮（nitric oxide，NO）产生量增加，细胞因子分泌增加，以及一些黏附分子和Fc受体的表达增加[25]等。巨噬细胞通过内吞、分泌肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IL-1、IL-6以及产生活性氧和NO来杀灭肿瘤细胞[26]。本研究拟通过观察重组黑芝免疫调节蛋白（recombinant Ganoderma atrum immunomodulatory protein，rFIP-gat）在体外对小鼠巨噬细胞RAW264.7经典活化M1型的影响，探索rFIP-gat抗肿瘤作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

RAW264.7细胞 中科院上海生命科学研究院细胞库。rFIP-gat为上海交通大学青蒿素研究实验室利用酵母表达并纯化所得。

HBSS（Hank's balanced salt solution）、DMEM高糖培养基、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS） 美国Hyclone公司；胎牛血清、质量分数0.05%胰蛋白酶（1∶250）、青霉素-链霉素双抗 美国Gibco公司；中性红溶液 生工生物工程股份有限公司；亚甲蓝溶液（含质量分数1.25%戊二醛及0.6 g/mL亚甲蓝的HBSS）、亚甲蓝洗脱液（含体积分数50%乙醇、49%PBS、1%乙酸） 德国默克公司；戊二醛 上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1G超净工作台 苏州净化设备有限公司；5804R离心机 德国Eppendorf公司；HERA cell vios 160i二氧化碳培养箱 美国Thermo Fisher公司；CFX 384多通道荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司；DMi1倒置显微镜 德国Leica微系统有限公司；Infinite M200 pro多功能酶标仪 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及细胞毒性的测定

RAW264.7细胞以2.5×105个/mL、100 μL/孔接种在96 孔培养板中，在5% CO2、37 ℃的培养箱中培养24 h。培养基为添加了体积分数10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基。分别用含终质量浓度0～100 μg/mL rFIP-gat或5 μg/mL伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA）、1 μg/mL脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）的培养基孵育24 h。除去培养基，PBS洗两次，按50 μL/孔加入亚甲蓝溶液，37 ℃孵育60 min。除去亚甲蓝溶液，PBS洗5 次。除去PBS，按100 μL/孔加入亚甲蓝洗脱液，平板旋转器上室温低速旋转20 min后，于570 nm波长处检测吸光度。以空白对照组（不添加rFIP-gat）细胞活力为100%，计算各组相对细胞活力。

1.3.2 细胞吞噬能力的测定

将RAW264.7细胞以2.5×105个/mL、100 μL/孔接种在96 孔培养板中，培养箱中培养24 h。分别用含1、2、4、8、16 μg/mL rFIP-gat或5 μg/mL ConA的培养基孵育24 h。除去培养基，PBS洗两次，按100 μL/孔加入中性红溶液（1 mg/mL），培养箱孵育30 min。除去中性红溶液，PBS洗两次，按100 μL/孔加入细胞裂解液，水平摇床振荡30 min后，于540 nm波长处检测吸光度，细胞吞噬能力与A540nm成正比。

1.3.3 NO浓度的测定

将RAW264.7细胞以2.5×105个/mL、100 μL/孔接种在96 孔培养板中，培养箱中培养24 h。分别用含20、40、60、80、100 μg/mL rFIP-gat或1 μg/mL LPS的培养基孵育24 h。按50 μL/孔取各孔中培养基于一个新的96 孔培养板中。预先将试剂盒中1 mol/L NaNO2标准品用细胞培养基稀释成0、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L。按50 μL/孔将标准品加入96 孔培养板中。按50 μL/孔依次加入室温Griess Reagent I和Griess Reagent II，混匀，540 nm波长处测定吸光度。

1.3.4 RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR测定

将RAW264.7细胞以2.5×105个/mL、1 mL/孔接种在12 孔培养板中，培养箱中培养24 h。分别用含1、2、4、8、16 μg/mL rFIP-gat或5 μg/mL ConA的培养基培养6 h，用于检测TNF-α mRNA的表达量；分别用含0.5、5、50 μg/mL rFIP-gat或1 μg/mL LPS的培养基培养6 h，用于检测rFIP-gat和LPS单独干预时iNOS mRNA的表达量；分别用含10 μg/mL rFIP-gat、1 μg/mL LPS、10 μg/mL rFIP-gat+1 μg/mL LPS的培养基培养6 h，用于检测rFIP-gat和LPS单独及共同干预时iNOS mRNA的表达量。除去培养基，PBS洗两次，裂解液裂解细胞用于总RNA提取。用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，用Nanodrop纳米分光光度计测定RNA质量浓度和纯度。RNA反转录后进行实时荧光定量PCR分析，以β-actin作为内参基因。引物设计见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 Primers used for qPCR

1.4 数据统计与分析

应用GraphPad Prism 7软件进行数据处理与作图，数据用平均值±标准差表示，采用t检验进行统计学分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 rFIP-gat对RAW264.7细胞毒性的分析

图1 rFIP-gat对RAW264.7细胞活力的影响Fig. 1 Effects of different concentrations of rFIP-gat on viability of RAW264.7 cells

如图1所示，rFIP-gat质量浓度在0～100 μg/mL范围内对RAW264.7细胞没有毒性，且能显著促进其增殖；与空白对照组相比，rFIP-gat质量浓度为0.1 μg/mL时差异极显著（P＜0.01）；质量浓度为1～100 μg/mL时差异高度显著（P＜0.001）。

2.2 rFIP-gat对RAW264.7细胞吞噬能力的影响

图2 rFIP-gat对RAW264.7细胞吞噬能力的影响Fig. 2 Effects of different concentrations of rFIP-gat on phagocytic ability of RAW264.7 cells

如图2所示，不同质量浓度rFIP-gat处理后RAW264.7细胞吞噬能力均有所提高。与空白对照组相比，rFIP-gat质量浓度超过2 μg/mL时能够极显著提高RAW264.7细胞的吞噬能力（P＜0.01，P＜0.001）。

2.3 rFIP-gat对RAW264.7细胞iNOS mRNA表达量及NO产生量的影响

图3 rFIP-gat对RAW264.7细胞iNOS mRNA表达量的影响Fig. 3 Effect of rFIP-gat on iNOS mRNA expression in RAW264.7 cells

如图3所示，rFIP-gat质量浓度为0.5、5、50 μg/mL时，RAW264.7细胞iNOS mRNA表达量与空白对照相比分别提高了0.76、5.05、136.45 倍，具有剂量依赖性。当rFIP-gat质量浓度超过5 μg/mL时，其能够高度显著提高RAW264.7细胞iNOS mRNA表达量（P＜0.001）。rFIP-gat各质量浓度处理组RAW264.7细胞iNOS mRNA表达量都远低于1 μg/mL LPS处理组（其是空白对照组的1 360.64 倍）。

与空白对照组相比，10 μg/mL rFIP-gat单独处理、10 μg/mL rFIP-gat与1 μg/mL LPS共同处理和1 μg/mL LPS单独处理组RAW264.7细胞iNOS mRNA表达量均高度显著增加（P＜0.001）。10 μg/mL rFIP-gat单独处理时，RAW264.7细胞iNOS mRNA表达量是空白对照组的10.10 倍；10 μg/mL rFIP-gat与1 μg/mL LPS共同处理组和1 μg/mL LPS单独处理组RAW264.7细胞iNOS mRNA表达量均是空白对照组的2 000 倍左右，且两组之间无显著性差异。

图4 NO浓度标准曲线Fig. 4 Standard curve for nitrate concentration

图5 rFIP-gat对RAW264.7细胞NO产生能力的影响Fig. 5 Effect of rFIP-gat on the production of NO in RAW264.7 cells

如图4所示，经回归处理，NO浓度和吸光度的回归方程为y＝156.1x-8.488，R2＝0.999 5，在0～100 μg/mL范围内线性关系良好。如图5所示，在0～100 μg/mL范围内，随着rFIP-gat质量浓度的增加，NO的产生量逐渐提高。当rFIP-gat质量浓度超过80 μg/mL时，NO产生量显著增加（P＜0.05，P＜0.001）。可见，在一定质量浓度范围内，rFIP-gat对RAW264.7细胞NO产生量表现出剂量依赖性。

2.4 rFIP-gat对RAW264.7细胞TNF-α mRNA表达量的影响

图6 rFIP-gat对RAW264.7细胞TNF-α mRNA表达量的影响Fig. 6 Effect of rFIP-gat on TNF-α mRNA expression in RAW264.7 cells

如图6所示，rFIP-gat质量浓度为1～16 μg/mL时，随着其质量浓度的提高，RAW264.7细胞TNF-α mRNA表达量不断增加，且与空白对照组相比具有显著性差异（P＜0.05，P＜0.001）。5 μg/mL ConA组RAW264.7细胞TNF-α mRNA表达量是空白对照组的2.12 倍（P＜0.001）。可见，在一定质量浓度范围内，rFIP-gat能显著增加RAW264.7细胞TNF-α mRNA表达量，且具有剂量依赖性。

3 讨 论

由于天然FIP含量低[16]，直接从真菌中提取FIP费时费力，限制了研究的进行。因此，本课题组前期利用基因工程的手段在酵母中表达FIP再进行提取纯化，得到重组FIP并研究其功能。Cong Weiran[20]、Shu Yingli[22]等对FIP功能的研究也是利用此种方法。

在目前的研究中，FIP对肿瘤细胞有直接抑制和间接抑制两种效应。Liao等[27]发现FIP-gts（一种从松杉灵芝中分离的FIP）可通过促进自然杀伤细胞和巨噬细胞活化显著抑制人肺腺癌A549细胞的生长，从而调节其免疫功能，并预测其属于间接效应。Cong Weiran等[20]发现rFIPs（rFIP-SN和rFIP-glu）可以通过延缓G1/S转换直接抑制细胞周期进程，并促进人胶质母细胞瘤U-251 MG细胞凋亡；Shu Yingli等[22]发现在大肠杆菌中表达的rFIP-ppl（一种从鲑色波斯特孔菌中分离的FIP）对MGC823胃癌细胞具有显著的生长抑制和凋亡诱导作用，并预测其属于直接效应。

在前期的研究中发现，rFIP-gat可有效抑制MDAMB-231细胞从G1期向S期的转变，其可能是通过促细胞凋亡导致肿瘤细胞死亡[3]。但rFIP-gat的免疫调节作用与其抗肿瘤作用的关系，特别是其对巨噬细胞的影响还鲜见报道。rFIP-gat是灵芝免疫调节蛋白家族的新成员。本研究中通过亚甲蓝的毒性检测表明，rFIP-gat在0～100 μg/mL的范围内对RAW264.7细胞无毒性，因此本研究在此质量浓度范围内开展rFIP-gat对RAW264.7细胞活化影响的研究。

巨噬细胞是机体内重要的非特异性免疫细胞，其活化后可以吞噬肿瘤细胞[28]，因此有助于消灭发病早期的肿瘤细胞[29]。吞噬功能是巨噬细胞的重要功能之一，也是其杀伤肿瘤细胞的重要手段。本研究通过中性红吞噬实验分析rFIP-gat对RAW264.7细胞吞噬能力的影响，结果表明，rFIP-gat对RAW264.7细胞吞噬能力有促进作用。当rFIP-gat质量浓度超过2 μg/mL时，能够极显著提高RAW264.7细胞的吞噬能力。NO是巨噬细胞活化后分泌的一种气体分子，其作用有诱导肿瘤细胞凋亡、引起肿瘤细胞DNA损伤、抑制肿瘤细胞增殖等[26]。本实验采用Griess法对细胞的NO产生量进行测定。结果显示rFIP-gat单独处理RAW264.7细胞时可促进RAW264.7细胞产生NO，且有剂量依赖性。这与iNOS mRNA的实时荧光定量PCR结果相一致。

TNF-α具有多种生物学功能，除了可以参与免疫调节，还可以诱导肿瘤细胞调亡[30]。实时荧光定量PCR结果表明，rFIP-gat可促进TNF-α和iNOS mRNA的转录且具有剂量依赖性。巨噬细胞活化时产生细胞因子TNF-α，同时，TNF-α通过绑定iNOS基因上游启动子反应元件，引发iNOS基因的转录，从而诱导细胞产生大量NO[31]。

综上，推测rFIP-gat可以诱导RAW264.7细胞向M1型分化，表现为大量释放活性因子NO，上调TNF-α和iNOS mRNA的表达，增强RAW264.7细胞的吞噬作用，有利于巨噬细胞发挥抗肿瘤的作用。本实验结果为进一步研究FIP通过巨噬细胞途径发挥抗肿瘤作用提供依据。