张 扬，朱彩平，林杨楠，曹钰林，张一凡，方 豪

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西省食品与健康科学国际联合研究中心，陕西 西安 710119）

肝脏是脊椎动物体内的重要代谢器官，发挥着去除毒素、调节免疫、储存糖原、合成分泌性蛋白质等作用。肝损伤主要指肝细胞在乙醇、病毒、药物、毒物等因素的诱导下引发的病变。长期肝损伤不可修复，并会导致肝脏代偿性修复，即形成肝纤维化，可进一步发展为肝硬化或者肝癌[1-2]。临床上的多种药物可以引起肝损伤，如抗菌药物、中枢抑制药、抗肿瘤药等[3]。因此，从天然产物中提取保肝物质越来越引起人们的重视。

多糖是一种天然的高分子聚合物，广泛地存在于动植物和微生物中[4-5]。研究表明，多糖具有潜在的抗氧化[6-7]、抗癌[8]、抗衰老[9]及免疫调节[10-11]等多种功能，被广泛应用于食品医药业。平菇是我国最常见的食用菌类之一，因味道鲜美而受到广泛喜爱，含有丰富的碳水化合物、蛋白质、矿物质、维生素等营养素[12-13]。研究表明，平菇富含多糖，且平菇多糖（Pleurotus ostreatuspolysaccharide，POP）具有良好的抗氧化[14]、增强免疫力[15]、抗肿瘤[16]等功效。然而，POP的保肝作用尚鲜见报道。本实验拟研究POP对四氯化碳（CCl4）诱导雄性昆明种小鼠肝损伤的保护作用，为开发POP保肝产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性昆明种小鼠，体质量（20±2）g，购自西安交通大学实验动物中心，生产许可证号：SYXK（陕）2018-001。

新鲜平菇 陕西省西安市长安区大居安蔬菜批发市场。

无水乙醇、4%多聚甲醛溶液 西安晶博生物科技有限公司；谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、总甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒 南京建成生物工程研究所；所有试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

分析天平 北京BSISL有限公司；全波长酶标仪美国赛默飞世尔公司；匀浆机 美国Pro Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 POP的提取

新鲜平菇烘干、粉碎，得到平菇干粉，其水分质量分数为5.04%。称取25 g平菇干粉，加入1.0 L蒸馏水，充分搅拌后置于95 ℃水浴提取4 h。冷却后用纱布滤去不溶物，溶液以4 000 r/min离心20 min，取上清液，蒸发浓缩，加入4 倍体积的体积分数85%乙醇溶液沉淀8 h，抽滤得沉淀，再将沉淀复溶于一定体积蒸馏水中，用8 000～14 000 Da透析袋透析72 h，冷冻干燥后得到POP。

1.3.2 动物分组与处理

48 只雄性昆明种小鼠饲养于（22±2）℃、12 h光照/12 h黑暗室内，自由饮水进食。适应性饲养一周后将小鼠随机分为6 组，分别为空白对照组、模型组、阳性对照组、POP低/中/高剂量组（POP-L/M/H），每组8 只。空白对照组与模型组每天用0.2 mL生理盐水（0.1 mL/10 g）进行灌胃；阳性对照组用50 mg/（kg·d）的VC进行灌胃[17]；POP-L/M/H组分别用100、200、400 mg/（kg·d）的POP进行灌胃，连续给药28 d。在第22、23天对除空白组外的小鼠进行肝损伤造模，腹腔注射质量分数0.2% CCl4-花生油溶液，剂量为10 mL/kg mb，空白组注射花生油。在第28天的最后一次灌胃结束以后，所有小鼠禁食不禁水12 h，记录体质量，颈椎脱臼处死。

1.3.3 血清的制备

小鼠处死后立即眼球取血，将血液收集于1.0 mL离心管中，3 000 r/min离心10 min，制得血清立即存放于-20 ℃冰箱，待测。

1.3.4 血清指标的测定

按照试剂盒操作说明测定血清中AST、ALT、ALP活力及TC、TG、HDL-C、LDL-C浓度。

1.3.5 肝脏组织指标的测定

小鼠处死后立即解剖取出肝脏组织，称质量并记录，按下式计算小鼠肝脏指数。随后精确称取0.5 g肝脏组织，加入无菌生理盐水制成质量分数10%肝组织匀浆。将制备好的肝匀浆5 000 r/min离心10 min，取上清液并稀释至适宜浓度，按试剂盒操作说明测定肝脏中T-AOC、MDA浓度及T-SOD、CAT、GSH-Px活力。

式中：m1为小鼠肝脏质量/g；m2为小鼠体质量/g。

1.3.6 肝脏组织病理学检测

取小块肝脏组织，置于4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色[18]。制成切片后用光学显微镜观察肝细胞病变程度。

1.4 数据统计与分析

采用Excel软件作图，SPSS软件对实验数据进行处理和分析。实验数据以平均值±标准差表示。组间差异采用t检验，P＜0.05表示数据差异显著。

2 结果与分析

2.1 POP对小鼠体质量的影响

POP对小鼠平均体质量的影响如图1所示，第1～3周，各组小鼠在自然生长状态下，平均体质量呈上升趋势，且POP-H组小鼠平均体质量略高于其他各组小鼠。在第22、23天腹腔注射CCl4后，除空白组小鼠体质量继续增加外，其他组小鼠体质量均降低。另外，POP-L/M/H组的小鼠体质量下降程度随着POP剂量的增加而减少。可以看出，POP能够抑制CCl4引起的小鼠体质量下降。

图1 POP对小鼠平均体质量的影响Fig. 1 Effect of POP on average body mass in mice

2.2 POP对小鼠肝脏指数的影响

表1 POP对CCl4诱导肝损伤小鼠肝脏指数的影响Table 1 Effect of POP on hepatic index in mice with CCl4-induced liver injury

CCl4是一种被广泛用来诱导实验动物肝损伤的化学药物，CCl4进入机体可以产生高反应活性的三氯甲基自由基，从而引发肝脏内脂质过氧化反应并导致肝小叶中心坏死，进而引发肝坏死、肝纤维化、肝硬化等疾病[19]。同时CCl4作为一种典型的肝脏毒物，能够破坏肝细胞内蛋白质的合成及肝细胞膜结构和功能，使细胞膜的通透性增加并失去对大分子物质的阻碍能力，生物体内的大分子物质会回流入细胞膜内，从而导致肝细胞肿胀坏死[20]，最终表现为肝脏体积肿胀、质量增加。从表1可以看出，模型组小鼠肝脏指数极显著高于空白对照组小鼠（P＜0.01），说明模型组小鼠肝脏出现严重肿胀，造模成功。同时，POP-H组小鼠肝脏指数显著低于模型组（P＜0.05），且POP-H组小鼠极显著低于模型组（P＜0.01），说明POP对CCl4引起的肝脏肿胀有抑制效果，且与剂量呈正相关。

2.3 POP对肝损伤小鼠血清指标的影响

肝脏微粒体细胞色素P-450会激活进入肝脏内的CCl4，产生三氯甲基自由基，三氯甲基自由基会破坏细胞膜上的磷脂分子，使细胞膜完整性遭到破坏，引起细胞内各种酶的渗漏[21]。ALT和AST由于肝细胞膜的通透性被隔绝于肝细胞线粒体和细胞浆中（正常肝细胞ALT和AST不会渗漏[22]），因此血清中ALT和AST很少。当肝细胞受到自由基攻击或坏死时，细胞中的ALT和AST大量外泄，血清中的ALT和AST活力显著提高，标志着肝细胞遭到破坏，是鉴定肝损伤的重要指标。ALP正常情况下主要来自于骨骼，由胆道系统排泄，当肝脏受到损伤时，ALP会反流入血液从而引起血清中的ALP活力显著提高[23]。

表2 POP对CCl4诱导肝损伤小鼠血清中ALT、AST和ALP活力的影响Table 2 Effect of POP on ALT, AST and ALP levels in serum of mice with CCl4-induced liver injury

从表2可以看出，与空白对照组相比，模型组小鼠血清中ALT、AST及ALP活力均极显著升高（P＜0.01），说明小鼠肝细胞膜通透性增加，肝细胞酶发生渗漏，标志着肝细胞受到破坏，造模成功。POP-M/H组小鼠血清中ALT、AST及ALP活力相比模型组极显著降低（P＜0.01），说明POP能够保护由CCl4引起的小鼠肝损伤。

2.4 POP对肝损伤小鼠血脂水平的影响

动脉粥样硬化和心血管疾病通常由血清中TC、TG和LDL-C浓度的增高以及HDL-C浓度的降低引起[24]。CCl4产生的三氯甲基自由基及一系列活性氧与蛋白质共价结合导致蛋白合成障碍，影响脂质分解代谢，使TG大量积累。

表3 POP对肝损伤小鼠血清血脂水平的影响Table 3 Effect of POP on serum lipid levels in mice with CCl4-induced liver injury

由表3可知，与空白对照组相比，模型组的TC、TG和LDL-C浓度极显著提高（P＜0.01），说明造模成功。与模型组相比，POP-L/M/H组小鼠血脂水平均出现明显下降，其中POP-M组血清TC浓度显著降低（P＜0.05），TG及LDL-C浓度均极显著降低（P＜0.01）；POP-H组小鼠血清血脂浓度（除HDL-C外）均极显著降低（P＜0.01），且均接近空白对照组小鼠，说明POP能够有效降低血清中TC、TG和LDL-C浓度。

HDL-C是脂蛋白的一种，可运输机体组织内的胆固醇到肝脏，从而抑制心血管疾病的发生，低浓度的HDL-C有诱发动脉粥样硬化的风险。由表3可知，模型组小鼠血清中HDL-C浓度相比空白对照组极显著降低（P＜0.01），而POP-M/H组的小鼠血清中HDL-C浓度相比模型组极显著提高（P＜0.01），这一现象说明POP能够改善CCl4引起的小鼠HDL-C浓度下降，维持血液中TC、TG、LDL-C和HDL-C浓度的平衡，从而预防或缓解动脉粥样硬化和心血管疾病的发生。

2.5 POP对肝损伤小鼠肝脏酶活力的影响

MDA是脂质过氧化反应的终产物，是一种能对人体造成损伤的损害因子，通常被用来鉴别一系列的组织损伤，它的含量能反映体内氧化反应的程度[25]，因此本实验以MDA浓度反映机体内脂质过氧化的程度；SOD是生物体内重要的活性物质，能够清除机体内的有害物质如超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，间接地反映了机体清除体内氧自由基的能力[26]；T-AOC与机体健康存在密切联系，能反映机体防御体系抗氧化能力的强弱，这种防御体系主要通过清除机体内的活性氧以阻止脂质过氧化反应，阻断过氧化链[27]；CAT参与机体内活性氧的代谢，促进机体清除自由基以阻止细胞膜受到损伤[28]；GSH-Px能够催化分解机体内产生的，通常与SOD协同作用，SOD首先催化超氧阴离子自由基生成O2和H2O2，生成的H2O2在GSH-Px的催化下转换成H2O和O2[30]。因此，小鼠肝脏内的T-AOC及MDA、T-SOD、CAT、GSH-Px水平可以反映CCl4引起的小鼠肝损伤程度。

表4 POP对CCl4诱导肝损伤小鼠肝组织T-AOC及MDA、T-SOD、CAT、GSH-Px水平的影响Table 4 Effect of POP on MDA, T-SOD, T-AOC, CAT and GSH-Px levels in liver tissue of mice with CCl4-induced liver injury

从表4可知，模型组小鼠肝组织MDA浓度相比空白对照组极显著提高（P＜0.01），说明CCl4对小鼠肝脏造成损伤；同时，模型组小鼠肝组织T-SOD、CAT、GSH-Px活力及T-AOC极显著降低（P＜0.01），说明小鼠肝脏酶活力受到严重破坏，造模成功。POP-L/M/H组小鼠肝脏酶活力相比模型组均提高，MDA浓度降低，其中POP-M组小鼠肝组织MDA浓度极显著降低（P＜0.01）、T-SOD、T-AOC、GSH-Px水平极显著提高（P＜0.01），而POP-H组小鼠肝组织酶活力相比模型组均极显著提高（P＜0.01）。

2.6 POP对肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响

显微镜下观察可以发现空白对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞排列整齐，肝窦正常，细胞核结构清晰；模型组小鼠肝细胞变性明显，可见多处细胞坏死，且细胞有浸润现象，细胞核萎缩，出现固缩溶解现象（图2）。相比模型组小鼠，POP-L/M组小鼠肝组织细胞坏死虽然减少，但细胞浸润现象依然存在；POP-H组小鼠肝组织相比模型组小鼠病理损伤程度明显减轻，肝细胞排列比较整齐，细胞核较模型组圆润，坏死区域明显减少，炎性细胞浸润程度也明显降低。

图2 CCl4诱导肝损伤小鼠肝组织病理学观察结果（400×）Fig. 2 Histopathological examination of CCl4-induced liver injury in mice (400 ×)

3 结 论

相比模型组小鼠，POP-H组（400 mg/（kg·d））小鼠体质量降低程度有所减缓，肝脏肿胀程度减轻，肝脏病理学结构有明显改善，血清中AST、ALT、ALP活力极显著降低（P＜0.01），TC、TG和LDL-C浓度极显著降低（P＜0.01），HDL-C浓度回升，说明POP有助于预防动脉粥样硬化和心血管疾病；同时，MDA浓度极显著降低（P＜0.01），T-SOD、T-AOC、CAT和GSH-Px水平极显著提高（P＜0.01），说明POP能够抑制CCl4引起的肝脏内脂质过氧化反应，提高肝脏内抗氧化酶活力，保护小鼠肝脏。肝脏病理学研究结果也表明，POP可以明显减轻小鼠肝细胞所受的病理损伤。综上，POP对CCl4引起的小鼠肝损伤具有明显的保护作用，在保健食品和药物治疗方面有广阔的发展空间。