任海伟，石菊芬，蔡亚玲，范文广，姜启兴，李志忠,*，裴佳雯，王彦蕊

（1.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

生物活性肽是一类对人体功能具有积极作用，并可能最终影响健康的特殊蛋白质片段[1]。生物活性肽一般含有3～20 个氨基酸，不仅具有较高营养价值，还有促进矿物结合、免疫调节、抗菌、抗氧化、抗血栓、降胆固醇、降血压和抗肿瘤等生物学功能[2]。因其发全性高、来源丰富、生理功效明显和易于消化吸回等优点，生物活性肽一直是功能性食品的关注热点，其中抗氧化活性肽的研究较为广泛。研究表明，许多生物活性肽在母体蛋白中不一定有活性，但如果在体内或体外用适当生物学方法处理后，一些具有抗氧化活性的肽片段就会被释放[3]，从而能够保护身体免受活性氧（羟自由基、超氧阴离子自由基和H2O2等）和活性氮（NO、ONOO—、ONOOH）等自由基的攻击，预防相关疾病的发生[4]。

目前，抗氧化肽的制备主要有酶解法、微生物发酵法和化学合成法等方法，其中酶解法条件温和，水解程度易控制，能定位生产特定的肽，被视为一种常用的方法[5]。Cai Luyun等[6]使用碱性蛋白酶水解草鱼皮制备得到较高活性的抗氧化肽。李玉芬等[7]以海蜇加工下脚料为原料制备胶原蛋白肽，发现风味蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解时的水解度和还原力高于单一酶水解。另一方面，超声波因其空化效应、机械效应等特点在活性物质提取、酶解反应和高分子物质降解等方面具有积极作用，尤其超声作用能缩短酶解反应时间、提高酶解效率、增加产物得率，已广泛用于动植物源蛋白质和多肽的提取[8]。Zou Ye等[9]采用超声波辅助碱性蛋白酶水解猪脑制备得到了分子质量小、活性较强的抗氧化肽。Jia Junqiang等[10]用超声波辅助酶解法从脱脂小麦胚芽蛋白中制备得到血管紧张素转换酶抑制肽，发现超声波处理能促进酶解过程中疏水氨基酸的释放和血管紧张素转换酶抑制肽的生成。帅希祥等[11]利用澳洲坚果蛋白采用超声波辅助酶解法制备得到具有较强活性的抗氧化肽，酶解时间明显缩短。王军等[12]也采用超声波辅助酶解法从鲶鱼中制备得到了具有较强抗脂质过氧化和清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力的抗氧化肽。

胎盘又称为“紫河车”，《本草纲目》记载：胎盘味甘咸，性温，无毒，具有补血、补气、益精、美颜之功效。现代医学发现胎盘富含免疫活性肽、激素、微量元素及多种功能因子，具有调节体内激素水平、提高免疫、护肝、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等作用[13]。其中，胎盘因子（胎盘肽）由核苷酸、肽类和各种氨基酸等小分子组合而成，已被证实是一种无毒、无抗原的免疫调节物质，在临床保健、医药和生物制品领域已有应用，尤其对病毒、免疫缺陷及恶性肿瘤等疾病具有良好效果[14-16]。但由于人胎盘资源短缺或伦理约束等因素，利用羊、鹿、牛等动物胎盘水解制备具有特殊功能的生物活性肽逐渐成为关注热点。特别是羊胎盘的营养组成与人胎盘基本一致，合理的自然结构和丰富的营养成分使其成为动物胎盘的首选。藏系绵羊是我国青藏高原宝贵的遗传资源之一，分布在青海、甘南等高海拔寒旱地区，平均海拔4 km以上的世界屋脊孕育了独特的藏系绵羊品质，具有耐高寒、耐缺氧、适应性强等特性[17]。藏医学也认为藏系绵羊胎盘具有极高的营养和药用价值，对人体保健与疾病治疗具有积极功效，但其具体成分及其作用机理尚不明确，有待进一步研究。

本研究以藏系羊胎盘肽的制备和抗氧化能力分析为目标，以水解度和肽得率为考察指标，首先从木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶等6 种蛋白酶中筛选适宜的复合酶水解组合方案，并通过单因素和响应面优化试验考察超声波辅助酶法制备羊胎盘肽的工艺参数，探索不同酶解条件下羊胎盘肽的抗氧化活性差异，进而对优化条件下获得的羊胎盘肽的分子质量分布和氨基酸组成进行分析，以期为藏系羊胎盘的开发及在功能性食品中的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藏系羊胎盘为兰州名德农牧科技有限公司提供。

木瓜蛋白酶（比活力80×104U/g）、菠萝蛋白酶（比活力50×104U/g）、碱性蛋白酶（比活力2×104U/g）南宁庞博生物科技有限公司；胰蛋白酶（比活力25×104U/g）、动物蛋白水解专用复合酶（比活力1.5×103U/g）、中性蛋白酶（比活力6×104U/g） 北京索莱宝科技有限公司；总抗氧化能力测试盒 南京建成生物工程研究所；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA25高剪切分散乳化机 上海弗卢克流体机械制造有限公司；L-550台式低速离心机 湖南湘仪试验仪器开发有限公司；SH220N石墨消解仪 山东海能科学仪器有限公司；K9840半自动凯氏定氮仪 山东海能科学仪器有限公司；SpectraMax i3x酶标仪 美谷分子仪器公司；Ag1100高效液相色谱仪 美国发捷伦公司；1525高效液相色谱仪 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 羊胎盘原料的净化与均质

新鲜羊胎盘解冻后，用清水冲洗去除残留血迹、尘沙等污物，然后沥干羊胎盘表面水分，剪碎后进行高剪切分散乳化，达到匀浆状态后备用。经测定，羊胎盘蛋白质质量分数为87.59%（以干基计）。

1.3.2 羊胎盘的酶解方案筛选

以水解度和肽得率为指标，结合色泽、浑浊度和腥味等感官品质，从木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等6 种蛋白酶中筛选适宜的水解酶，酶解条件统一设置为酶添加量4 000 U/g、酶解时间1 h。然后利用筛选出的单一蛋白酶进行双酶同步复合酶解实验，酶解结束后立即沸水浴10 min灭酶，快速冷却至室温后3 900 r/min离心20 min，取上清液于100 mL容量瓶中定容，用于测定总氮和氨态氮含量，通过计算肽得率、水解度和理论分子质量，综合考量确定适宜的蛋白酶组合方案。

1.3.3 超声波预处理参数和酶解时间的单因素试验

在1.3.2节复合酶解方案确定的基础上，首先对藏系羊胎盘进行超声波预处理，处理结束后进入酶解反应，研究各参数对水解效果的影响。以水解度和抗氧化能力为指标，分别考察酶解时间（1、2、3、4、5、6 h）、超声时间（5、10、15、20、25、30 min）、超声温度（25、30、35、40、45、50 ℃）、超声功率（240、300、360、420、480、540 W）4 个因素对羊胎盘双酶复合酶解效果的影响。

1.3.4 超声波预处理参数和酶解时间的响应面优化试验

研究表明，水解度与肽得率、肽的分子质量分布和抗氧化能力密切相关，其中水解度是决定活性肽制备效率和活性高低的关键指标[18]。因此，在单因素试验结果基础上，以水解度为响应值，在固定酶添加量等水解条件的前提下，优化超声时间、超声温度、超声功率、酶解时间4 个因素对羊胎盘肽制备效果的影响。根据中心组合设计原理，采用Design-Expert 8.0.6软件进行4因素5水平的响应面优化试验，试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Variables and levels used for central composite design

1.3.5 酶解指标测定

水解度参考Cui Chun等[19]方法，按式（1）计算，其中氨态氮测定采用甲醛滴定法，总氮测定采用微量凯氏定氮法；肽得率按照式（2）计算；平均理论分子质量（mw）按式（3）计算[20-21]。

式中：N1为水解液中氨态氮含量/g；N为原料中总氮含量/g；N2为水解液中总氮含量/g；W为原料中总蛋白质含量/g。

1.3.6 抗氧化能力分析

参照试剂盒说明书中的2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）法，在405 nm波长处可测定ABTS阳离子自由基吸光度。6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）是一种VE类似物，具有和VE相近的抗氧化能力，以吸光度（y）和Trolox浓度（x）制作标准曲线，得到回归方程y=-0.862 3x+1.114 8，R2=0.993 9，从而确定羊胎盘肽的抗氧化能力，以Trolox当量表示。

1.3.7 分子质量分布的分析

利用高效液相色谱仪测定。色谱条件为：色谱柱TSKgel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流动相：乙腈-水-三氟乙酸40∶60∶0.1（V/V）；检测波长：紫外220 nm；流速：0.5 mL/min；柱温：30 ℃。其中绘制分子质量标准曲线所选的标准品为：细胞色素C（mw=12 400 Da）；杆菌酶（mw=1 450 Da）；乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（mw=451 Da）；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（mw=189 Da）。

1.3.8 氨基酸组成分析

采用高效液相色谱法，根据郭刚军等[22]方法略作修改。

羊胎盘原料上柱前处理方法：准确称取100.00 mg左右原料置入水解管，然后加入8 mL 6 mol/L的HCl溶液，再用氮气除氧3 min，调整流速使溶液呈沸腾状态后拧紧水解管盖，放入120 ℃烘箱中水解22 h，之后将水解管样品全部转移至容量瓶，加4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液中和，蒸馏水定容至25 mL后用双层滤纸过滤，取1 mL澄清液于1.5 mL离心管内15 000 r/min离心30 min，最后取400 μL上清液于取液相样品瓶，待测。

羊胎盘肽液上柱前处理方法：准确量取1 mL肽液样品，依次加入1 mL浓HCl和6 mL 6 mol/L HCl溶液，其余处理与羊胎盘原料处理方法相同。

色谱条件：O D S H Y P E R S I L色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：40 ℃；流动相：A相：8.0 g/L结晶乙酸钠加入225 μL三乙胺和5 mL四氢呋喃，用5%醋酸溶液调pH 7.2；B相：8.0 g/L结晶乙酸钠，用2%醋酸溶液调节pH 7.20，加入乙腈和甲醇各800 mL；流速：1.0 mL/min；紫外检测器：338 nm，262 nm。

1.4 数据处理

所有实验均进行3 次平行，单因素试验结果采用SPSS软件进行显著性差异分析，采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面中心组合试验。

2 结果与分析

2.1 藏系羊胎盘原料的氨基酸组成分析

表2 藏系羊胎盘的氨基酸组成及其含量Table 2 Amino acid composition of TSPP

如表2所示，藏系羊胎盘中的蛋白质高达80%以上，氨基酸总量为69.52%，主要包括Asp、Glu、Gly、Leu、Lys、Arg和Val等；其中Phe、Lys、Leu、Ile、Met、Val、Thr、His 8 种人体必需氨基酸质量分数为26.36%，必需氨基酸占总氨基酸的比值为37.92%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值达到61.08%。与其他来源羊胎盘相比，藏系羊胎盘中的Glu、Val、Met、Ile、Lys含量较高，其中Val、Met、Ile、Lys均为人体必需氨基酸。此外，藏系羊胎盘中还含有Glu、Gly、Leu、Arg等具有药用价值的氨基酸[23]，并且Tyr、Met、Cys、His和Phe等氨基酸还与抗氧化能力密切相关[24]。可见，藏系羊胎盘蕴藏着良好的营养价值和抗氧化潜力。

2.2 复合酶解方案的确定

2.2.1 单酶筛选

有研究认为N端氨基酸为强疏水性和弱带电性氨基酸（如Ala、Gly、Val和Leu）、中心氨基酸为具有强氢键作用的氨基酸（如Arg、Lys、His）时，小分子肽（Leu-His-X、Pro-His-X等）能表现出较强的抗氧化活性[4]。不同来源蛋白酶的酶切位点不同，会导致酶解产物存在很大差异，故有必要对藏系羊胎盘原料筛选适宜的蛋白酶。

表3 不同种类蛋白酶的推荐条件和酶解效果比较Table 3 Comparison of hydrolysis efficiencies of different proteases under recommended conditions

如表3所示，6 种蛋白酶的单一酶解效果差异较大。就水解度而言，中性蛋白酶水解度最高（38.16%），碱性蛋白酶和动物蛋白水解复合酶次之，胰蛋白酶最低（21.68%）。因为胰蛋白酶是一种Ser内切蛋白酶，仅能水解R1为Arg或Lys残基侧链的肽键，当提供肽键的氨基酸为Pro时水解受阻，而藏系羊胎盘中含量相对较高的Pro可能会对酶解反应形成阻碍作用[27]。从肽得率角度看，中性蛋白酶的肽得率最高（10.55%），其次为菠萝蛋白酶和动物蛋白水解复合酶，胰蛋白酶的肽得率仍为最低（7.35%），且理论分子质量最高。另一方面，由于碱性蛋白酶具有一定特异性，能作用于Ala、Phe、Leu和Ile参与形成的多种肽键[21]，故水解度和肽得率相对较高，但水解液的腥味较重，因此胰蛋白酶和碱性蛋白酶予以排除。

另外，庞博公司生产的动物蛋白水解复合酶是一种复合内切酶，其酶切位点为Ala-、Leu-、Val-和Tyr-，而藏系羊胎盘中的这些氨基酸含量较高，故水解较为充分，水解度和肽得率相对较高，所得肽的理论分子质量仅330 Da左右。木瓜蛋白酶具有广泛特异性，酶切位点主要为Arg-、Lys-、Phe-和X-，能获得较高的水解度和肽得率[28]。菠萝蛋白酶属无特异性蛋白酶，所制得的水解液呈浅黄色、腥味较轻，且酶解条件为中性，操作简便。综合考虑，从6 种蛋白酶中选择木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和动物水解复合酶进行后续的双酶复合酶解实验，进一步筛选适宜的复合酶解方案。

2.2.2 双酶复合水解的组合方案筛选

由于蛋白酶对肽键作用具有一定专一性，单一蛋白酶水解时只能从某几个固定的氨基酸残基进行水解，水解程度有限；复合酶解法能强化水解度，得到更低分子质量的水解产物[29]。如图1所示，不同蛋白酶复合酶解的水解度和肽得率有显著性差异（P＜0.05）。其中菠萝蛋白酶和中性蛋白酶均为无特异性蛋白酶，故菠+中组合的水解度（19.61%）显著低于其他5 种方案（P＜0.05），木+中组合的水解度最高达到37.24%。另一方面，木+中组合的肽得率最高，动+中组合次之，较单一蛋白酶的水解效果均得到大幅提升，但由于动+中组合得到的水解液呈深棕色且有一定腥味，故予以排除。

图1 不同双酶组合方案时的水解度和肽得率Fig. 1 DH and peptide yields with different enzyme combinations

图2 不同双酶组合方案时的抗氧化活性Fig. 2 Antioxidant activities of hydrolysates prepared with different enzyme combinations

结合图2抗氧化能力分析，木+中组合的抗氧化能力（0.91 mmol/L）显著高于其他4 种组合（P＜0.05），且水解液澄清、呈亮黄色状态，此时水解度与肽得率分别为37.24%和13.54%。该结果与刘建伟等[30]研究报道一致。木瓜蛋白酶能有效水解羊胎盘中的Arg、Lys、Phe等肽键，生成小分子多肽；中性蛋白酶的酶切位点广泛，二者酶解过程中形成良好的协同作用，使得具有抗氧化能力的氨基酸残基以及肽链暴露在外，大大增强了其抗氧化能力。综合水解度、肽得率和抗氧化能力3 个指标评判，木+中组合的酶解效果较好，故选择该组合进行后续的超声波辅助酶解试验。

2.3 超声波辅助双酶法制备羊胎盘肽的工艺优化

2.3.1 单因素试验结果

由图3可知，随着酶解时间的延长，水解度和抗氧化能力均呈现先升高后降低的变化趋势，酶解第5小时的水解度高达51.14%，酶解4 h的抗氧化能力最高达到0.51 mmol/L。在酶解初始阶段（1～4 h），底物浓度相对较高，酶作用使底物蛋白迅速降解为肽片段，水解度逐渐升高，平均肽链长度随之下降，抗氧化能力亦逐渐增强。但随着反应的进行（4～5 h），当蛋白质水解为多肽的速度小于多肽水解为氨基酸的速度时，游离氨基酸增多，水解度达到峰值；但同时会导致与抗氧化能力相关的多肽结构序列发生变化，使肽产物的抗氧化能力快速下降。随着底物被逐渐消耗（5～6 h），底物蛋白与酶的接触机率大幅下降以及可供酶切的位点减少导致水解反应放缓[31]，水解度快速下降，这与许英一等[32]研究结果一致。因此，为获得抗氧化能力较强的酶解产物，必须严格控制酶解程度。

图3 酶解时间对水解度和抗氧化能力的影响Fig. 3 Effect of enzymolysis times on degree of hydrolysis and antioxidant activity hydrolysis

图4 超声功率对水解度和抗氧化能力的影响Fig. 4 Effect of ultrasonic power on DH and antioxidant activity and antioxidant capacity

由图4可知，水解度和抗氧化能力随着超声功率的上升亦呈现先升高后下降趋势，当功率为420 W和360 W时二者达到最高值，分别为48.07%和0.98 mmol/L。当超声波与酶解反应偶合时，超声作用能使底物蛋白空间结构发生改变，增加底物与蛋白酶的结合位点，有效提高酶解效果，使肽键断裂，水解度增强；同时使具有抗氧化能力的肽片段增加，在超声功率为360 W时表现出最高的抗氧化能力。当超声功率继续增至420 W时，超声能量的释放加速了介质中的质量传递作用，有效促进反应体系的传质进程，使水解度达到最高值。但随着超声功率的继续增加（＞420 W），超声空化效应会破坏蛋白分子构象，导致酶活性下降，水解度和抗氧化能力均迅速降低[12]，这与蓝尉冰等[33]研究结果一致。可见，适宜的超声功率有利于发挥酶解作用，使羊胎盘肽表现出良好的抗氧化能力。

随着超声处理时间的延长，整个酶解反应体系更趋于均匀，底物蛋白的空间构象发生积极变化，埋藏在蛋白质内部的酶切位点暴露，促进底物与酶结合[34]，从而使水解度和抗氧化能力均逐渐增大，反应趋于完全。由图5可知，当超声处理第15分钟时抗氧化能力出现峰值0.63 mmol/L，处理第20分钟时水解度达到最高值52.15%。但过长时间的超声处理会产生热效应和剪切力，不仅会使部分底物蛋白的活性部位遭受破坏，也会使酶解反应体系的温度随之升高，超过酶的最适反应温度从而抑制酶活力，导致酶解反应速率下降。另一方面，过量的超声能量释放会使肽片段降解为游离氨基酸，从而失去抗氧化能力。因此，初步确定超声波处理时间为15～20 min。

图5 超声时间对水解度和抗氧化能力的影响Fig. 5 Effect of ultrasonic times on the degree of hydrolysis and antioxidant capacity

图6 超声温度对水解度和抗氧化能力的影响Fig. 6 Effect of ultrasonic temperatures on the degree of hydrolysis and antioxidant capacity

由图6可知，当超声温度为35 ℃和30 ℃时，水解度和抗氧化能力达到最高值。超声波是一种具有加热和空化效应的能量辐照，对酶解反应可产生促进和抑制的双重效果。在适宜温度范围内（＜30 ℃），加热效应占主导，超声场下的酶解反应体系吸回能量后加速了底物蛋白和酶作用位点的释放，促进水解反应进程，使活性肽片段暴露，抗氧化能力升高。当超声温度继续升高，则会使游离氨基酸增多，抗氧化能力开始下降，而水解度则继续升高达到最大值43.5%。但温度高于35 ℃后，超声空化效应产生的自由基会对酶活中心形成破坏作用，导致酶活性降低，使得酶解反应速率下降，水解度降低[35]。

另外，超声功率、温度和时间等因素对水解度、抗氧化能力的影响呈高度相关性，且抗氧化能力随反应体系的因素变化敏感性较高，均先于水解度发生变化，原因可能是抗氧化能力的高低与平均肽链长度、产物的末端氨基酸残基、分子质量等肽的微分子结构关系密切，这一点在赵婕媛等[36]研究结果中得到证实。

2.3.2 响应面优化试验结果

2.3.2.1 响应面试验设计与结果

采用Design-Expert8.0.6软件，在单因素试验结果基础上，以水解度为指标，进行4因素5水平的响应面优化试验，共计30 组，设计方案及结果如表4所示。

表4 响应面试验设计与结果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.2.2 模型方程的建立及显著性分析

Design-Expert 8.0.6软件进行多元回归拟合得到回归方程：水解度＝55.39+0.16A-0.20B+0.061C+1.90D+2.42AB-2.68AC-2.33AD+2.71BC+0.53BD+2.42CD-4.77A2-3.27B2-2.28C2-4.71D2。式中各项系数的绝对值表示单因素对水解度参数的影响程度，正负反映影响方方。

由表5可知，水解度的回归模型极显著（P＜0.001）；失拟项中F值为1.54，P＝0.332 2＞0.05，不显著，表明模型拟合度良好，能较好解释响应中的变异。模型的回归系数R2为0.952 2，说明此方程对试验拟合度结果比较好，误差小；R2Adj为0.907 6，说明该模型能解释90.76%响应值的变化，能很好预测超声波辅助酶解制备羊胎盘肽的工艺参数。另一方面，该模型中回归系数的显著性检验显示，一次项D，交互项AB、AD和CD对水解度的影响高度显著（P＜0.01）；二次项A2、B2、C2和D2，交互项AC和BC对水解度的影响极显著（P＜0.001）。比较4 个因素的F值大小可知，影响因素的主次顺序依次为：超声时间＞超声温度＞酶解时间＞超声功率。

表5 水解度回归模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model for DH

2.3.2.3 响应面优化分析

图7 各因素交互作用对水解度影响的响应面图Fig. 7 Response surface plots showing the effect of interaction among various factors on DH

如图7所示，随着各因素水平的升高，水解度均呈现先增加后减少的趋势。图7a、b、c显示，沿D因素轴方方的响应面坡度明显比较陡峭，说明超声时间对水解度变化的影响较超声温度、超声功率和酶解时间大。另一方面，等高线是响应面在水平方方的投影，椭圆等高线表示两因素交互作用显著，圆形等高线表示两因素交互作用不显著[37]。图7中6 组交互作用的等高线图显示，超声温度与超声功率、酶解时间与超声功率之间的交互作用最强，等高线均为椭圆形；其次是超声功率与超声时间、超声时间与酶解时间、超声温度与酶解时间；超声时间与超声温度二者的交互作用最弱，等高线为圆形，再次验证了单因素与交互项对水解度影响的主次顺序，且与表4中显著性检验结果一致。

2.3.3 最佳酶解工艺参数的确定

Design-Expert 8.0软件对试验的优化结果为超声温度25.36 ℃、超声时间16.56 min、超声功率437.65 W、酶解时间4.88 h，该最优条件下的水解度预测值为55.67%。采用优化后的参数进行验证实验，为方便操作，条件设为超声温度25.5 ℃、超声时间16.5 min、超声功率438 W、酶解时间4.9 h，经5 次平行实验后测得酶解液的水解度为（55.22±0.12）%，与模型预测值55.67%无明显差异；肽得率为15.52%；抗氧化能力为1.08 mmol/L，说明拟合模型优化出的酶解参数较为准确。

2.4 藏系羊胎盘肽的氨基酸组成和分子质量分布

图8 羊胎盘肽液分子质量分布色谱图Fig. 8 Chromatogram of peptides in TSPP hydrolysate

肽片段长短与抗氧化能力高低密切相关，肽片段过长（超过20 个氨基酸）则结构相对复杂，具有抗氧化能力的氨基酸残基可能被包埋其中，导致无法发挥功能活性；适宜长度的肽片段能表现出良好功能活性[38]。含有2～9 个氨基酸（分子质量500～2 500 Da）的寡肽比大分子蛋白质和多肽具有更强的抗氧化能力，二肽或三肽（200～500 Da）与单个氨基酸相比也表现出较强的抗氧化能力[4]。结合图8和表6可知，羊胎盘经超声波辅助酶解后得到的绝大多数肽为小分子低聚寡肽物质，其中分子质量低于2 000 Da的肽占95.02%，分子质量低于1 000 Da的肽占89.04%，分子质量低于500 Da的肽占74.99%。由于小分子低聚寡肽易被人体吸回，能直接参与组织蛋白质合成代谢，具有吸回快、功能活性良好等特点，故推测藏系羊胎盘肽表现出的抗氧化能力与其较低的肽分子质量分布有关系，不同分子质量段位肽片段对应的抗氧化能力需进一步深入研究。

另一方面，肽的抗氧化能力在很大程度上取决于氨基酸组成及其序列顺序结构。由表7可知，藏系羊胎盘肽中的酸性氨基酸Glu含量最高，因其侧链有氨基或羧基而具有螯合金属离子和作为质子供体的能力，对肽的抗氧化能力表现有一定贡献[39]。Zhuang Yufeng等[40]用碱性蛋白酶和中性蛋白酶复合水解罗非鱼鱼皮，得到N端为Glu的三肽（Glu-Gly-Leu）具有强抗氧化能力。除Glu外，藏系羊胎盘肽中的Gly和Asp含量也相对较高，Asp也是酸性氨基酸，Gly的R基为氢原子，能通过与自由基结合进而增强肽的抗氧化能力。此外，藏系羊胎盘肽中还包含一定量Leu、Ala、Pro和Val等氨基酸，这些氨基酸在文献报道的抗氧化肽序列中多有出现。Huang Yipeng等[41]酶解马鲛鱼得到了Ser-Lys-Lys-Gly-Leu、Gln-Ala-Pro-Leu-Asn-Pro-Lys-Ala等8 种抗氧化肽。Kou Xiaohong等[42]酶解鹰嘴豆蛋白得到序列为Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pro的抗氧化肽。Lee等[43]从鸭皮副产物中得到具有抗氧化能力的八肽His-Thr-Val-Gln-Cys-Met-Phe-Gln。由此推断，藏系羊胎盘肽表现出的较强抗氧化能力与其氨基酸组成密不可分。下一步，课题组将继续从肽片段分离纯化和化学结构等角度分析其氨基酸序列，进而精准确定羊胎盘肽的抗氧化构效关系。

表7 藏系羊胎盘肽的氨基酸组成Table 7 Amino acid composition of peptides from TSPP hydrolysate

3 结 论

通过比较分析单一蛋白酶和复合蛋白酶的酶解方案，筛选得到木瓜蛋白酶和中性蛋白酶同步复合酶解的作用效果最好。在此基础上，通过单因素试验和响应面试验优化得到超声波辅助复合酶解制备藏系羊胎盘肽的最佳条件为酶解时间4.9 h，超声温度25.5 ℃、超声时间16.5 min、超声功率438 W，该条件下水解度达55.22%，肽得率为18.52%，抗氧化能力为1.08 mmol/L。制备得到的羊胎盘肽中分子质量低于2 000 Da的肽占比为95.02%，绝大多数为小分子低聚寡肽，而且藏系羊胎盘肽中富含有Glu、Gly、Asp等氨基酸，使其具有良好抗氧化能力。本研究为藏系绵羊胎盘制备抗氧化肽的工业化生产提供了技术参考，也为肽的分离纯化和氨基酸序列结构分析奠定了理论基础。