李 文，王 陶，董玉玮，李同祥

（徐州工程学院 江苏省食品资源开发与质量发全重点建设实验室，江苏 徐州 222018）

乳酸菌在自然界中广泛存在，一般认为是发全的（generally regards as safe，GRAS）[1]。其作为益生菌，具有免疫调节、抑制病原菌、控制肠道内稳态、抗胃酸、抗胆汁酸阻力、抗过敏、抗肿瘤、延缓衰老等多种功能[2-5]，被广泛用于食品行业，如乳制品、面包、发酵蔬菜、肉类和鱼类等[6-8]。乳酸菌体内具有谷氨酸脱羧酶，因此，可以发酵生产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）。GABA作为中枢神经系统的重要神经递质，具有抗焦虑、降血压、调节情绪、延缓脑衰老、营养神经等多种生理功能[9-11]。采用乳酸菌发酵的方式增加食品中GABA含量是发全的，能够增强食品的营养和功能特性，且赋予食品更好的口感，对于乳酸菌发酵食品基质的选择显得尤为重要。

鹰嘴豆被称为“豆中之王”，富含蛋白质、氨基酸、维生素、膳食纤维、及钙、铁、镁等成分，具有降胆固醇、降血糖、降血压等多种保健功效[12]，经乳酸菌发酵后，鹰嘴豆的功能特性可以进一步提升，同时，乳酸菌的益生功能也可以得到很好的体现。若发挥乳酸菌的益生功效，必须克服宿主体内的物理和化学障碍，以顺利进入宿主体内。除具备耐受胃肠道中酸和胆盐的能力[13]，还需要能够黏附宿主的肠壁细胞，这是乳酸菌发挥益生作用的先决条件[14]。此外，益生菌的分泌物或者分解产物应为抗菌物质，从而能够有效抑制致病菌的增殖，改善胃肠道微生态环境[15]。

前期经诱变选育得到1 株具备在鹰嘴豆乳中发酵产GABA的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）UL-4[16]。本研究选取此菌株，动态监测其在鹰嘴豆乳中的生长和产GABA能力；并通过测定菌株的耐酸耐胆盐特性、抑菌性能、表面特性、降解胆固醇和甘油三酯的能力评价其益生特性，以期为进一步利用此菌株开发功能性食品提供良好的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌UL-4、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、大肠杆菌（Escherichia coli）保藏于本实验室。

GABA标准品 美国Sigma公司；胆固醇测定试剂盒、甘油三酯测定试剂盒 长春汇力生物技术有限公司；猪胆盐、胆固醇、葡萄糖、无水乙酸钠、柠檬酸铵、K2HPO4•3H2O、MnSO4•H2O、MgSO4•7H2O、吐温-80、邻苯二甲醛、β-巯基乙醇、二甲苯、正己烷、蔗糖酯等均为国产分析纯；牛肉膏、酵母膏、蛋白胨等均为生化试剂。

MRS（de Man Rogosa Sharpe）培养基：葡萄糖20.0 g、牛肉膏15.0 g、酵母膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、无水乙酸钠5.0 g、柠檬酸铵2.0 g、K2HPO4•3H2O 2.62 g、MnSO4•H2O 0.198 g、MgSO4•7H2O 0.58 g、吐温-80 1.0 mL、蒸馏水1 000 mL，pH 6.0～6.5，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。LB液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母浸膏5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.2，121 ℃灭菌20 min。LB半固体培养基：在LB液体培养基中加0.75 g/100 mL琼脂粉。LB固体培养基：在LB液体培养基中加1.5 g/100 mL的琼脂粉。胆盐培养基：MRS液体培养基中分别加入0.03、0.15、0.3 g/100 mL的胆盐，121 ℃灭菌20 min。胆固醇培养基：MRS培养基中加入0.01 g/100 mL胆固醇、0.01 g/100 mL蔗糖酯、0.1%（体积分数，下同）Tween-80、0.5%冰乙酸、0.2 g/100 mL巯基乙酸钠，pH 6.0，121 ℃灭菌15 min。甘油三酯培养基：MRS培养基中加入5% Tween-80和1%猪油、0.2 g/100 mL巯基乙酸钠，pH 6.0，121 ℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

LRH-150型生化培养箱 上海益恒实验仪器有限公司；PB-20型pH计 德国Sartarius公司；64RL高速冷冻离心机 美国Beckeman公司；1100型高效液相色谱仪美国Agilent公司；722型分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；SynergyHI酶标仪 美国BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳杆菌UL-4发酵鹰嘴豆乳产GABA

1.3.1.1 菌悬液的制备

将保藏于甘油管的植物乳杆菌UL-4接种于MRS培养基，37 ℃厌氧培养24 h，再以3%的接种量接种到MRS培养基中，37 ℃厌氧培养14～16 h。将活化后的乳酸菌用0.85 g/100 mL生理盐水清洗2 次，获得菌悬液。

1.3.1.2 鹰嘴豆乳的制备与发酵

选取优质鹰嘴豆，清水冲洗后，室温浸泡12 h，以豆水比1∶10（g/mL）加入水，煮沸15 min，放入食物搅拌器中磨浆，双层纱布过滤，弃滤渣，滤液中加入0.2 g/mL的谷氨酸钠，108 ℃灭菌15 min。待豆乳冷却后，按5%的接种量接入处理好的菌悬液，37 ℃发酵48 h。从0 h开始，定期取适量发酵液低温冷冻离心（10 000×g，4 ℃，10 min），检测上清液中的GABA含量，并采用梯度平板法，对发酵鹰嘴豆乳中的乳酸菌进行活菌计数。

1.3.1.3 GABA产量测定

采用高效液相色谱法检测GABA产量[17]。

衍生试剂的配制：0.4 mol/L的硼酸缓冲液：称取硼酸2.47 g，用双蒸水溶解，调节pH 10.4，定容至100 mL容量瓶中；邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）溶液配制：称取40 mg OPA，溶解于10 mL乙腈中，再加入40 μL β-巯基乙醇，混匀。

样品衍生：依次吸取5 0 0 μ L硼酸缓冲液、100 μL OPA、100 μL发酵上清液，涡旋振荡30 s，5 min后用0.22 μm微孔滤膜过滤。

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18反相分析柱（4.60 mm×250 mm，5 μm）；检测器：二极管阵列检测器（G1315 B）；流动相A为20 mmol/L的醋酸钠（pH 7.3），流动相B为乙腈；检测波长：334 nm；柱温：25 ℃；流速：48 cm3/h；进样方式：手动进样；进样量：20 μL。洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution of mobile phase

标准曲线配制：将质量浓度为1 mg/mL的GABA标准溶液稀释为质量浓度分别为100、200、300、400、500、600 μg/mL的6 种标准工作液，经OPA衍生后，进样检测，以GABA的色谱峰面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标，绘制GABA标准曲线。

1.3.2 耐酸性测定

调节MRS培养基的pH值依次为2、3、4，分别接种体积分数4%的乳酸菌，37 ℃厌氧培养0、1、2、3 h，取不同处理条件下的菌悬液适当稀释后，进行平板菌落计数，按照式（1）计算菌株存活率[18]：

式中：Nl为各时间段的活菌数/（CFU/mL）；Nf为0 h的活菌数/（CFU/mL）。

1.3.3 胆盐耐受性测定

将活化好的乳酸菌接种至含0.03%、0.15%、0.3%的胆盐培养基中，37 ℃静置培养，在培养0、1、2、3 h后取出对应的菌悬液，适当稀释，然后做平板菌落计数[19]。并按照1.3.2节公式计算菌株存活率。

1.3.4 表面凝集性测定

吸取一定量生长至对数期的乳酸菌液于离心管中，4 000 r/min离心10 min，倒去上清液，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.0）洗涤2 次后，调节菌悬液在600 nm波长处的吸光度0.8左右。吸取5 mL菌悬液放在37 ℃培养箱中静置培养2 h，在不摇动的情况下，轻轻吸取200 µL上层悬浮液，测定其在波长600 nm处的吸光度[20]。菌体表面凝集性按式（2）计算：

式中：Ai为菌悬液初始吸光度；At为菌悬液静置后吸光度。

1.3.5 表面疏水性测定

按照1.3.4节方法制备菌悬液，运用微生物黏着碳烃化合物法检测其表面疏水性[21]。使用直径10 mm的圆底试管，取4 mL已调整好浓度的菌液于试管中，再取1 mL的正己烷加入到管中，不加正己烷的作为对照组，盖好塞子，在室温条件下于旋涡混匀器上振荡1 min，轻轻放置在试管架上，待15 min后分层。将无菌注射针头快速插入到下层水相中，吸取3.0 mL作为实验组，以Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液作为空白对照，在600 nm波长处测定吸光度，表面疏水性按式（3）计算：

式中：A0为对照组吸光度；A1为实验组吸光度。

1.3.6 抑菌特性分析

1.3.6.1 指示菌活化

将金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌的甘油管，分别接种至LB液体培养基中，放在37 ℃、120 r/min摇床中培养12 h，使其达到对数生长期后备用。

1.3.6.2 抑菌活性测定

采用牛津杯法，测定乳酸菌发酵液的抑菌活性。将3 种指示菌分别用LB半固体培养基稀释至浓度为106～107CFU/mL，倒平板。凝固后，把灭过菌的牛津杯放在琼脂表面上。设置4 组样品：1）乳酸菌发酵上清液；2）乳酸菌发酵上清液，用6 mol/L NaOH溶液调节pH 6.5；3）空白培养基；4）空白培养基，用乳酸调节pH值与发酵上清液相同。以上4 组样液均用无菌过滤膜（0.22 μm）过滤除菌，分别吸取200 μL加到牛津杯中，于37 ℃的恒温培养箱中，培养24 h后，观察并测量抑菌圈直径[18]。

1.3.7 对胆固醇的降解特性

乳酸菌接种于胆固醇培养基，37 ℃静置培养48 h，5 000 r/min离心10 min后，取上清液，按照胆固醇试剂盒的说明，测定0 h及48 h发酵上清液的胆固醇浓度[22]。胆固醇降解率按式（4）计算：

式中：Ci为0 h胆固醇浓度/（mmol/L）；Ct为48 h后胆固醇浓度/（mmol/L）。

1.3.8 对甘油三酯的降解特性

乳酸菌接种于甘油三酯培养基，37 ℃静置培养48 h，5 000 r/min离心10 min后，取上清液，按照甘油三酯试剂盒的说明，测定0 h及48 h发酵上清液的甘油三酯浓度[22]。甘油三酯降解率按式（5）计算：

式中：C0为0 h甘油三酯浓度/（mmol/L）；C1为48 h后甘油三酯浓度/（mmol/L）。

1.4 统计分析

实验数据均为3 次重复结果的平均值，表示为 ±s，采用SPSS 16.0对数据进行统计分析，采用Duncan ANOVA进行多重比较，P＜0.05，差异显著；P＜0.01，差异极显著。

2 结果与分析

2.1 菌株发酵鹰嘴豆乳产GABA分析

图1 鹰嘴豆乳发酵产GABA的时间曲线Fig. 1 Time-course curves of GABA production and viable cell count during chickpea milk fermentation

如图1所示，当植物乳杆菌UL-4接种到鹰嘴豆乳中后，迅速生长，8 h可达稳定期，乳酸菌活菌数为7.81（lg（CFU/mL）），比刚接入时增加了1.54 个数量级，因此，鹰嘴豆乳可以作为良好的功能性食品基质。GABA在最初接种的8 h的生成较为缓慢，8 h后生成迅速，48 h产量到达最大值371.14 mg/L，之后无显著变化（P＞0.05）。曾有研究报道黑豆乳、豌豆可通过乳酸菌发酵产GABA[23-24]，鲜有乳酸菌发酵鹰嘴豆乳产GABA的报道。

2.2 菌株对酸的耐受性

具有一定的酸耐受性，才能通过胃酸屏障进入肠道特定部位发挥作用。由表2可以看出，pH值为2时，1 h后，菌株的活菌数和存活率有所下降（P＜0.05），之后无显著变化（P＞0.05），3 h后的存活率为46.67%；pH 3条件对菌株生长无显著影响（P＞0.05），活菌数和存活率皆保持在较高水平；而pH 4条件下，随着时间的延长，菌株的活菌数由7.20（lg（CFU/mL））上升为7.44（lg（CFU/mL）），存活率3 h后升至174.21%。总体而言，该菌株显示出对酸较好的耐受性。

表2 益生菌耐酸实验结果Table 2 Acid tolerance of UL-4

2.3 菌株对胆盐的耐受性

胆盐对微生物的生长繁殖具有明显的抑制作用，因此，只有在较高胆盐含量中保持活力并能够繁殖的菌株才能抵抗住肠道消化作用而存活[19]。由表3可看出，随着培养时间的延长，胆盐质量分数为0.03%时，菌株没有受到不良影响，活菌数和存活率有所上升（P＜0.05）。随胆盐质量分数增大，活菌数和存活率均受到一定影响，3 h后，菌株依然保持较高活菌数和存活率，0.15%和0.3%胆盐质量分数下，存活率分别为91.81%和56.28%。可见，菌株对胆盐具有一定耐受性。

表3 益生菌胆盐耐受结果Table 3 Bile salt tolerance of UL-4

2.4 菌株的表面性质

在消化过程中，消化道会不断回缩，许多微生物进入消化道时，开始具有较多数量，但很快被排出。因此，益生菌能够发挥作用的前提是确保菌株能够通过黏附作用定植于消化道内。通过测量菌株的表面疏水性和凝集特性评估菌株的表面特性，菌株的表面凝集性和表面疏水性分别为52.49%和61.50%，能够较好地定植于消化道表面并进行繁殖。

2.5 菌株的抑菌活性

图2 菌株对3 种指示菌的抑制作用Fig. 2 Inhibitory activities of the strain against three indicator pathogens

通过探究菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌的抑制作用所形成的抑菌圈直径大小评估益生菌对体内致病菌感染的预防和抑制能力，确保益生菌发挥益生特性。如图2所示，发酵上清液的抑菌圈直径均大于13.00 mm，说明菌株对3 种致病菌具有较好的抑制作用，菌株对金黄色葡萄球菌抑制效果最明显，抑菌圈直径为15.77 mm，其次为大肠杆菌，抑菌圈直径为14.40 mm，对伤寒沙门氏菌也有一定的抑制作用，抑菌圈直径为13.36 mm。调酸的空白培养基有抑菌圈，但其抑菌圈直径小于对应发酵上清液，调为中性的发酵上清液与空白培养基皆无抑菌活性。可见，除酸性pH值对致病菌的抑制作用外，发酵上清液中应该还存在一些非酸性的抑菌活性物质，而此类抑菌物质需在酸性条件下发挥作用。

表4 菌株对致病菌的抑菌活性Table 4 Inhibition zone diameters when various pathogens were exposed to the strain

2.6 菌株降胆固醇和降甘油三酯特性

将菌株培养在含胆固醇和甘油三酯的培养基中，测定0 h和48 h此两种物质的含量，结果见表5。0 h时，胆固醇、甘油三酯浓度分别为1.27、6.28 mmoL/L；经乳酸菌发酵48 h后，浓度分别降为0.34、5.08 mmol/L，降解率分别为73.23%和19.11%。此菌株具备降解这2 种物质的能力。

表5 菌株对胆固醇和甘油三酯的降解作用Table 5 Degradation rates of cholesterol and triglyceride by the strain

3 讨 论

采用植物乳杆菌UL-4发酵鹰嘴豆乳48 h后，鹰嘴豆乳中GABA产量为371.14 mg/L，活菌数为7.81（lg（CFU/mL）），一方面，能够满足人体每日GABA的需求量为30～100 mg的要求，另一方面，鹰嘴豆乳中的乳酸菌活菌数能够满足益生产品对于乳酸菌数至少要达到106CFU/mL的要求[25]。因此，植物乳杆菌UL-4具备良好的开发功能性鹰嘴豆乳的潜力。

当人体摄入益生菌或含益生菌产品后，益生菌本身需要克服体内环境影响才能发挥其正常的益生作用。正常人的胃液在消化食物时pH值为3～4，空腹时胃液的pH值在2.0左右，食物在胃中的消化时间一般为1～2 h。本实验所得植物乳杆菌在pH 2的环境中，3 h能保持46.67%的存活率，pH 3的环境能够保持91.81%的高存活率，而在pH 4的环境有高达174.21%的存活率，为其能正常通过胃液进入肠液奠定了基础。正常情况下，小肠内胆盐在0.03%～0.3%[26]，而高含量的胆盐具有抗菌活性。本实验植物乳杆菌UL-4对低含量胆盐具有较好的抗性，3 h后存活率高达382.83%，即使在0.3%胆盐环境下，3 h后仍可保持56.28%的存活率，显示出了较好的耐胆盐特性。

乳酸菌要想发挥作用，须先定植到细胞上，可以通过竞争营养及黏附部位阻挡病原菌与细胞表面受体的结合，调节肠道内菌群平衡。经测定，植物乳杆菌UL-4表面疏水性和凝聚性分别为61.50%和52.49%，说明该菌株可能会黏附在人体肠道上皮细胞和黏膜表面上，发挥其益生功能。朱振军等[27]报道罗伊氏乳杆菌LT018的疏水性和凝聚性分别为54.65%和67.20%，与本研究的类似。影响细菌表面疏水性与凝集性的因素有很多，比如细菌表面非极性基团的多少，表面蛋白、脂磷壁酸、菌毛、荚膜等结构，而这些因素因菌株的不同而存在差异。

肠道微生物构成的屏障是肠道屏障的重要组成部分，对宿主肠道功能的发挥具有重要作用。乳酸菌可以通过发酵过程中产生的乳酸、苯乳酸、细菌素等代谢产物，达到抑菌的目的，抑制和杀灭革兰氏阴性菌、过氧化氢酶阳性细菌、大肠杆菌类和沙门氏菌等病原菌，调节肠道菌群平衡[28-30]。植物乳杆菌UL-4显示出对3 种肠道致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌有较好的抑制作用，且发酵上清液的抑菌效果好于用乳酸调至等pH值的空白培养基的抑菌效果，这与林龙镇等[31]的研究结果一致，一方面是由于菌株产生的乳酸等有机酸的抑菌作用，另一方面是由于菌株产生的在酸性条件下发挥作用的抑菌活性物质。有研究发现非酸性活性物质是在中性条件下发挥作用，而本研究所得菌株更适合应用于调节人的肠道[32-33]。

血清中胆固醇、甘油三酯含量过高，会诱发冠心病、脑中风、高血压等心脑血管疾病，严重影响人类健康。因此，对胆固醇、甘油三酯的降解能力成了衡量益生菌益生特性的又一重要指标。植物乳杆菌UL-4对甘油三酯和胆固醇的降解率分别为73.23%和19.11%，说明菌株具备良好的降解这两种物质的能力。综上，植物乳杆菌UL-4具有发酵生产富含GABA鹰嘴豆乳的能力，同时显示出较好的益生特性，因此，具备良好的应用潜力。