王 卓，赵冬冬，郭宇荣，杨 澜，温 爽，申伟祺，程 佳，孙耀贵，王文魁，段智变

(山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801)

肉鸡腹水综合征(Ascites syndrome,AS)是一类非传染性、营养代谢性疾病，主要临床症状包括腹水、右心肥大、肺和肝充血肿大，缺氧是诱发AS的主要原因[1]。缺氧刺激肺部血管收缩、重构，肺动脉压力升高，右心负荷增加，促进右心代偿性肥大直至衰竭，肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension,PAH)和心脏衰竭(Heart failure,HF)是AS的主要病理环节[1]。缺氧下活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)大量产生，刺激细胞凋亡发生异常，造成组织器官损伤，促进疾病的形成[2-3]。

信息沉默调节因子1(Silent information regulator 1,SIRT1)在机体中广泛表达且具有高度保守性，调节缺氧、氧化应激、凋亡等多种细胞生命活动[3]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α(PPARY coactirator-1α,PGC-1α)是SIRT1的下游因子，调节与抗氧化、线粒体功能相关基因的表达[4]。研究显示，缺氧环境会导致SIRT1和PGC-1α表达及活性降低，激活SIRT1可以增加心和肺对缺氧的抗性[3-5]。

课题组前期研究结果表明，复方中药通过保护血管功能、抑制肝纤维化有效防治AS[6-8]，研究表明，黄芪、当归、丹参等中药能增加SIRT1表达，抵抗氧化应激，抑制细胞凋亡[9-12]，因此，本试验采用课题组前期造模方法复制肉鸡腹水综合征模型，通过测定35日龄AS肉鸡心肺组织中SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax蛋白含量和血清总超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量，研究肉鸡腹水综合征的发病机理以及中药复方的防治机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物 健康1日龄罗斯肉鸡304羽(雌雄不限)及三段式喂养，饲料购自山西文水县大象禽业有限公司。

1.2 中药复方汤剂制备 采用课题组前期试验方法[6-8]，主要中药黄芪、当归、丹参、茯苓、大腹皮组方配比为3 ∶2 ∶2 ∶2 ∶1，清水浸泡30 min后煎煮40 min，纱布过滤，收集药液，重复3次，合并药液减压蒸馏浓缩至1 g/mL，-20 ℃保存备用，饲喂前温化处理。

1.3 主要化学试剂及仪器设备 石蜡切片机(上海跃进医疗器械厂产品)，倒置荧光显微镜(IX81-F72FL/PH，日本Olympus公司)，鸡SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax蛋白ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，酶标分析仪(RT-6100，美国Rayto公司)，总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒(南京建成生物工程研究所)，丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 肉鸡腹水综合征模型复制与样本采集 采用本课题组多因素法[6-8]复制肉鸡AS模型，肉鸡常规育雏饲养至7日龄，随机分为5组：对照组、模型组、中药复方高、中、低剂量组(各组饲养条件见表1)。35日龄时，每组随机抽取10羽肉鸡，空腹心脏采血，室温静置2 h，4 ℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液即为血清；颈动脉放血处死肉鸡后，剖检并观察病理变化，取部分右心室和肺组织制作病理切片，部分右心室和肺组织于冰冷生理盐水中缓慢冲洗，洗净后用洁净滤纸吸干，称重，按质量 ∶体积=1 ∶9加入生理盐水，用匀浆机制备组织匀浆，3 000 r/min离心20 min，取上清液。

表1 试验分组、药物剂量及饲养方式

1.5 心、肺组织病理学观察 取肉鸡右心室和左侧肺下方部分组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，常规切片(5 μm)，H.E.染色观察病理学变化。

1.6 心、肺组织蛋白含量检测 按试剂盒说明书以ELISA方法检测心或肺组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2和Bax蛋白含量。

1.7 血清相关指标检测 按说明书对样品预处理，采用黄嘌呤氧化酶法检测肉鸡血清T-SOD活性，采用硫代巴比妥酸法检测肉鸡血清MDA含量。

2 结果

2.1 临床症状和剖检变化 AS肉鸡精神沉郁，羽毛杂乱，腹部胀满，呼吸困难。剖检病鸡可发现腹腔内有大量透明黄色液体；心包积液，右心室壁薄、质软、扩张；肺水肿淤血；肝体积肿大，颜色发暗，有黄色沉积物；肾脏充血肿大，部分有白色沉积物。与模型组相比，中药复方高、中、低剂量组肉鸡临床症状和剖检变化均有改善。

2.2 肉鸡心组织病理学变化 结果表明(见中插彩版图1)，35日龄时，对照组肉鸡心组织细胞排列有序，大小均匀，结构完整；与对照组相比，模型组心肌细胞结构紊乱，连接疏松，交错排列，肌纤维呈波浪状，细胞核增大、浓染，结缔组织增生，可见炎性细胞浸润；与模型组相比，中药复方高、中、低剂量组心组织细胞结构、形态均有不同程度改善。

2.3 肉鸡肺组织病理学变化 结果表明(见中插彩版图2)，35日龄时，对照组肺组织细胞结构清晰、完整，细胞排列整齐；与对照组相比，模型组肺组织结构疏松，被膜增厚，炎性细胞浸润，肺小动脉充血，副支气管平滑肌层萎缩、管腔中大量红细胞渗出，肺毛细管萎缩、狭窄、破裂；与模型组相比，中药复方高、中、低剂量组肺组织细胞结构较完整，肺小动脉内皮细胞、平滑肌细胞排列有序，副支气管平滑肌层结构良好、管腔中红细胞渗出减少，肺毛细血管结构较完整，但仍有大量炎性细胞浸润。

2.4 心组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2和Bax蛋白含量 由表2结果表明，35日龄时，与对照组相比，模型组肉鸡心组织SIRT1、PGC-1α和Bcl-2蛋白含量极显著降低(P<0.01)，Bax蛋白含量极显著升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值极显著降低(P<0.01)；与模型组相比，中药复方高、中、低剂量组肉鸡心组织SIRT1、PGC-1α和Bcl-2蛋白含量极显著或显著升高(P<0.01或P<0.05)，Bax蛋白含量极显著或显著降低(P<0.01或P<0.05)，Bcl-2/Bax比值极显著升高(P<0.01)；中药复方高、中、低剂量组间肉鸡心组织SIRT1和PGC-1α蛋白含量无显著差异(P>0.05)；与中药复方低剂量组相比，中药复方高剂量组肉鸡心组织Bcl-2蛋白含量显著升高(P<0.05)；与中药复方低剂量组相比，中药复方高、中剂量组肉鸡心组织Bax蛋白含量显著降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值显著升高(P<0.05)。

表2 中药复方对肉鸡心组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2和Bax蛋白含量的影响

注：同行数据右角所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01);下表同

2.5 肺组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2和Bax蛋白含量 由表3结果表明，35日龄时，与对照组相比，模型组肉鸡肺组织SIRT1、PGC-1α和Bcl-2蛋白含量极显著降低(P<0.01)，Bax蛋白含量极显著升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值极显著降低(P<0.01)；与模型组相比，中药复方高、中、低剂量组肉鸡肺组织SIRT1、PGC-1α和Bcl-2蛋白含量极显著或显著升高(P<0.01或P<0.05)，Bax蛋白含量极显著或显著降低(P<0.01或P<0.05)，Bcl-2/Bax比值极显著或显著升高(P<0.01或P<0.05)；与中药复方低剂量组相比，中药复方高、中剂量组肉鸡肺组织SIRT1蛋白含量显著升高(P<0.05)；中药复方高、中、低剂量组间肉鸡肺组织PGC-1α、Bcl-2和Bax蛋白含量以及Bcl-2/Bax比值无显著差异(P>0.05)。

指标对照组模型组中药复方高剂量组中药复方中剂量组中药复方低剂量组SIRT1 (ng/g)92.83±3.95Aa66.02±9.72Bc90.38±5.97Aa90.95±6.06Aa79.55±9.52AbPGC-1α (nmol/g)0.796±0.057Aa0.579±0.062Cc0.756±0.046ABab0.740±0.051ABab0.686±0.067BbBcl-2 (pg/g)458.91±23.43Aa347.56±44.30Bc427.88±30.92Aab420.16±20.68Aab406.56±28.21AbBax (ng/g)21.05±1.17Cc27.54±2.25Aa23.08±2.14BCbc23.55±1.11BCb24.57±1.57ABbBcl-2/Bax1.004±0.096Aa0.587±0.130Cc0.856±0.095ABb0.821±0.074ABb0.764±0.096BCb

2.6 血清T-SOD活性和MDA含量 由表4结果表明，35日龄时，与对照组相比，模型组肉鸡血清T-SOD活性极显著降低(P<0.01)，MDA含量极显著升高(P<0.01)；与模型组相比，中药复方高、中、低剂量组肉鸡血清T-SOD活性极显著或显著升高(P<0.01或P<0.05)，MDA含量极显著或显著降低(P<0.01或P<0.05)；中药复方高、中、低剂量组间肉鸡血清T-SOD活性差异不显著(P>0.05)；与中药复方低剂量组相比，中药复方高剂量组肉鸡血清MDA含量显著降低(P<0.05)。

指标对照组模型组中药复方高剂量组中药复方中剂量组中药复方低剂量组T-SOD (U/mL)233.51±14.76Aa191.19±14.83Bb226.29±15.59Aa226.20±20.13Aa220.60±19.37ABaMDA (nmol/mL)2.871±0.193Cd4.142±0.193Aa3.514±0.197Bc3.602±0.285Bbc3.840±0.132ABb

3 讨论

研究表明，肉鸡腹水综合征实验模型构建方法有低温诱发法、高钠诱发法、饲喂高能饲料法、低压舱缺氧诱发法、单侧肺动脉结扎法等，本试验复制课题组前期多因素法构建的肉鸡腹水综合征模型[6-8]，AS肉鸡出现典型的腹水症状。研究表明，AS肉鸡心肺都有严重的病理损伤，且早于腹水形成，肺小叶毛细血管淤血，支气管扩张或狭窄，心肌细胞变性、坏死，细胞间毛细血管充血、出血，炎性细胞浸润和结缔组织增生[13]，表明心肺损伤和功能障碍影响气体交换，引起缺氧，增加心脏负荷，右心代偿性肥大进而失去代偿直至衰竭，导致全身血液循环障碍，加重组织广泛病变，参与AS发生发展，与本试验结果相符。

ROS是氧代谢的副产物。缺氧环境导致细胞ROS不断积累，与脂质发生过氧化反应，生成大量MDA；缺氧和氧化应激下细胞凋亡异常，促进疾病发生发展[2-3,14]。Bcl-2抑制细胞凋亡，Bax可诱导细胞凋亡，Bcl-2/Bax比值可综合反映细胞凋亡状态[2]。研究表明，AS肉鸡肝组织MDA含量显著增加[14]；高水平ROS导致心肌细胞凋亡，引发心脏功能障碍和HF[15]；诱导SOD表达，能清除过量ROS，延缓细胞衰老，抑制血管疾病[14-15]；短期缺氧刺激心肌细胞抵抗凋亡，长期缺氧引起心室壁增厚、结构异常以及心肌细胞凋亡[16]；6 h和12 h缺氧激活肺上皮细胞Bcl-2促进细胞增殖，24 h和48 h缺氧则激活Bax引发细胞凋亡[17]。本试验结果显示，35日龄模型组AS肉鸡心肺组织Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达增高，Bcl-2/Bax比值显著降低，抗氧化能力降低，参与并诱导AS发生发展。

SIRT1属于NAD+依赖型脱乙酰化酶，在缺氧、氧化应激、慢性炎症等相关疾病中发挥重要作用[3]。激活SIRT1调节其下游靶蛋白PGC-1α起始和持续反应，通过增加Mn-SOD、过氧化氢酶(Catalase,CAT)等抗氧化蛋白表达和线粒体生物学功能，可缓解或治疗PAH和HF[3-5]。研究表明，AS肉鸡肺组织血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表达增加[7]；SIRT1能抑制缺氧下VEGF的表达，抑制血管增殖[3]；但在缺氧环境下，多种因素导致SIRT1下调使其保护作用受到限制[3]。本试验结果显示，35日龄模型组AS肉鸡心肺组织SIRT1、PGC-1α蛋白表达显著降低，说明机体对缺氧环境的保护作用降低，导致AS发生发展。

中兽医学分析AS证候为气血双虚、气滞血瘀、水湿停聚，本试验所用中药复方具有气血双补、活血行气、利水渗湿的功效[6-8]。研究表明，黄芪可补气升阳、益气固表、利水消肿；黄芪甲苷和黄芪皂苷IV可以激活SIRT1/PGC-1α信号通路，增加SOD活性，减少MDA含量，增加Bcl-2/Bax比值，保护细胞免受氧化损伤、抑制凋亡[9-10]。当归可补血活血、养血润燥；黄芪和当归组方可上调SIRT1表达，降低急性心肌梗死的细胞凋亡和纤维化，抵抗心肌肥厚[11]。丹参可活血祛瘀、凉血消痈；丹参酮IIA通过激活SIRT1，保护心肌细胞免受低氧损伤，抗心肌肥厚，缓解HF，防治AS[12,18]。茯苓可健脾渗湿；茯苓和黄芪等组方能改善小鼠心肌能量代谢，减轻氧化损伤[19]。大腹皮可行气宽中、行水消肿，是肝硬化腹水中常用中药[20]。本试验结果显示，中药复方能增加35日龄肉鸡心肺SIRT1和PGC-1α蛋白表达，上调心肺Bcl-2表达、下调Bax表达，Bcl-2/Bax比值显著升高，增加血清T-SOD活性、减少MDA含量，表明中药复方通过激活SIRT1和PGC-1α，增加肉鸡抗氧化能力，减少氧化损伤和心肺细胞凋亡异常，有效防治AS。