刘媛媛 综述，王建功 审校

063000河北 唐山， 唐山市人民医院 肿瘤综合治疗一科

肺癌是世界范围内患病人数及癌症相关死亡人数最多的癌种[1]。最新的统计数据显示，我国肺癌在所有癌症中发病率居首位，且发病率逐渐升高[2]。多个大型研究(如IPASS、NEJ002、OPTIMAL、LUX-Lung3和LUX-Lung6等)使得第一、二代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)成为一线治疗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)敏感突变型非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的标准药物，但最终仍不可避免地出现耐药问题，其中T790M突变是发生频率最高也是研究最多的耐药突变，针对此突变研制出以奥希替尼为代表的第三代EGFR-TKIs。AURA3研究[3-4]结果显示奥希替尼二线治疗获得性T790M突变的患者，其无进展生存期(progression-free survival,PFS)对比传统含铂双药治疗为10.1个月vs4.4个月，总生存期(overall survival,OS)为26.8个月vs22.5个月。而FLURA Ⅲ期研究[5-6]结果显示奥希替尼一线治疗对比标准一代EGFR-TKIs(吉非替尼、厄洛替尼)治疗局部晚期或转移性EGFR突变型NSCLC，其PFS显著延长 (18.9个月vs10.2个月)，OS则为38.6个月vs31.8个月。虽然研究数据显示出了奥希替尼的优越性，但最终也仍无可避免地出现耐药问题。

近年来出现的第三代EGFR-TKIs数量较多，如：Nazartinib(EGF816)，Olmutinib(HM61713)，Naquotinib(ASP8273)，Osimertinib(奥希替尼)，WZ4002, Roceletinib等，但被FDA及国家药品监督管理局双批准的只有奥希替尼。且WZ4002和Roceletinib是目前基本上已经处于完全终止申报程序的EGFR-TKIs，故本文主要以奥希替尼为第三代EGFR-TKIs代表性药物进行相关综述。EGFR-TKIs的耐药机制十分复杂，具有显著的瘤间和瘤内异质性，大体分为EGFR相关性耐药机制：EGFR再突变、T790M减少或缺失、EGFR扩增;EGFR非相关性耐药机制：间质表皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)、人表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor 2,HER2) 扩增、RAS突变、BRAF突变、磷酸酰肌醇-3-激酶突变、磷酸酶和张力蛋白类似物 (phosphatase and tensin homolog,PTEN) 缺失、成纤维细胞生长因子受体 (fibroblast growth factor receptor,FGFR) 通路异常、细胞表型转化、细胞周期基因改变、致癌基因融合、Bcl-2样蛋白11缺失多态性、极光激酶A(aurora kinase A,AURKA)的激活、Src通路激活与整合素、AXL的激活、氧化供能途径的改变、肝配蛋白A型受体2 (EPH receptor A2,EPHA2) 过表达等。现就上述机制及相关治疗策略研究进展进行综述，分述如下：

1 EGFR相关性耐药机制及治疗策略研究进展

1.1 EGFR再突变

1.1.1 C797S突变EGFR第20号外显子797位点上的丝氨酸被半胱氨酸取代而发生错义突变时被称为C797S突变。体外实验首次观察到C797S突变是在人源性EGFR突变细胞系长期暴露于WZ4002的情况下发生的[7]。奥希替尼作为一线治疗时，C797S突变的频率为7%，是仅次于MET扩增的第二种耐药机制[8]；而对二线使用奥希替尼后进展的患者进行检测时发现C797S突变频率居于耐药机制首位，占比14%[9]。研究[10-11]发现T790M和C797S位置不同则耐药不同，后续治疗也有差异：1) 当T790M与C797S为顺式结构即位于同一等位基因时，第一、三代EGFR-TKIs联合或单药使用无效，而目前正在研究中的第四代EGFR-TKIs[12]可能对此突变有效；2) 当T790M与C797S为反式结构即位于不同等位基因时，对第三代EGFR-TKIs耐药，而对第一、三代EGFR-TKIs联合使用敏感。NSCLC小鼠模型(L858R/T790M/C797S突变)的体外实验[13]显示，EAI045(第四代变构抑制剂)与西妥昔单抗联合使用可以有效防止EGFR二聚化，但是EAI045与西妥昔单抗联合使用的效果、副反应的严重程度等仍需要进一步研究证实；此外，有文献[14]指出布加替尼(ALK抑制剂)对L858R/T790M/C797S突变有抑制作用。

1.1.2 其他罕见突变

1.1.2.1 L718突变 L718残基位于EGFR激酶结构域的ATP结合位点上，该残基可发生L718Q、L718V两种突变，突变的产生可以导致空间结构变异，进而阻碍奥希替尼与EGFR的结合。文献报道[15]，一位71岁老年晚期女性肺腺癌患者在使用奥希替尼治疗13个月后出现L718Q突变。且EGFR/T790M/L718Q对所有TKIs耐药，但当为双突变体即L718Q突变与T790M不同时出现时，则对奥希替尼、吉非替尼和阿法替尼相对敏感。另外，L718残基突变在大多数情况下并不存在C797突变，这提示L718突变导致的耐药机制可能是独立存在的。目前已有文献指出L718突变在T790M突变消失的前提下，可能对第一、二代TKIs敏感[16]。

1.1.2.2 G796突变 G796突变包括G796D/S/R三种突变。其中，Ou等[17]的研究第一次指出奥希替尼治疗耐药后出现G796S/R前沿突变，并表明G796位于奥希替尼芳环下方，当L718残基或G796残基发生突变时则会使这两种残基与奥希替尼的溶剂前芳环共同形成的“疏水三明治”的作用失效，从而使奥希替尼与激酶结构域的结合失效，最终导致耐药。Zheng等[18]的研究发现了G796D突变，此突变与奥希替尼的复合物结构模拟显示,突变的G796残基的侧链会和奥希替尼的分子表面发生碰撞，导致结合亲和力的降低或丧失。这一现象则可能为下一代抑制剂提供新的研究方向。

1.1.2.3 L792突变 Chen等[19]的研究显示L792F/H/Y突变可影响奥希替尼苯环上的甲氧基群，进而对奥希替尼产生耐药性，并指出L792突变与C797S的耐药机制具有相似作用。而Zhang等[20]则从体内和体外分别研究了L792H以及G796R突变，结果显示这两种突变与L858R/T790M均为顺式突变，无论EAI045单药还是EAI045与西妥昔单抗联合使用均疗效甚微，但奥希替尼与西妥昔单抗联合使用时，L792H突变体的50%生长抑制浓度值有所降低，除此之外，多西紫杉醇单药表现出强烈的抑制突变细胞增殖的现象，但是是否有效，仍需要大量的基础及临床实验证实。

1.1.2.4 G724突变 G724S突变[21]发生在EGFR激酶的ATP结合环内，通过改变蛋白结构等导致EGFR-TKIs耐药。有文献表明[22]，阿法替尼在体外成功地克服了G724S介导的奥希替尼的抗性。为明确该突变的具体影响，还需要对耐药机制开展更多更深入的研究。

除了上诉罕见突变，V802F[17]、P794S[19]、F795C[23]、L747P[24]、G719A、S768I[25]、V834L、C620W、H870R、P596L[26]等其他罕见突变也有相关文献报道。

1.2 T790M减少或缺失

Le等[26]的研究发现了T790M缺失与保留的病例中耐药机制的不同。当突变缺失时，耐药机制主要表现为非EGFR依赖通路；而在突变保留的病例中，耐药性则主要表现为EGFR三级突变或旁路信号通路激活。Niederst等[7]提出当T790M突变缺失时，第一代EGFR-TKIs可能将重新发挥疗效。而Oxnard等[27]则认为T790M突变缺失并不意味着再次对第一代EGFR-TKIs敏感，而可能是竞争性耐药突变的过度生长所致。另外，还指出耐药时间与耐药机制的相关：早期耐药往往与T790M缺失有关，晚期耐药与EGFR三级突变有关。研究指出T790M缺失时往往中位生存期偏短。当T790M突变缺失且不伴有其余突变时，细胞毒药物可能是一种治疗方式。

1.3 EGFR扩增

EGFR扩增机制除了耐药后EGFR-ex19del等位基因拷贝数增加外，还有EGFR野生型等位基因的扩增。Kim等[28]的研究发现在奥希替尼治疗后的肿瘤组织中EGF mRNA的表达增加8倍，而且在H1975细胞中EGF表达水平约为亲本细胞的4.5倍，并对奥希替尼产生耐药性。上述结果提示临床工作者在治疗期间且患者知情时，可动态检测EGF的变化，以便及时了解是否出现耐药性、调整治疗方案。

2 EGFR非相关性耐药机制及治疗策略研究进展

2.1 MET和HER 2扩增

Papadimitrakopoulou等[9]在2018年发表的文献中指出，MET扩增是奥希替尼二线治疗后第二种常见的耐药机制，占比19%，HER2扩增占比5%；而在FLAURA研究[8]中，MET和HER2扩增分别占耐药机制的15%、2%。体内外实验显示克唑替尼、曲妥珠单抗T-DM1单药或联合奥希替尼；奥希替尼与MET抑制剂PF02341066或SGX523联合；卡马替尼和阿法替尼联合使用均在一定程度上对抑制MET扩增有效[29-32]。另外，2019年在AACR年会上公布的Ⅰb期TATTON研究[33]的2个研究队列的中期结果显示，奥希替尼联合沃利替尼在经第三代EGFR-TKIs治疗出现MET扩增的EGFR突变型NSCLC患者中显示出可接受的安全性和初步的抗肿瘤疗效。针对此联合方案的Ⅱ期SAVANNAH临床研究正在进行。研究[34]表明曲妥珠单抗对携带HER2突变的肺癌患者疗效不大，但阿法替尼联合西妥昔单抗可延缓HER2扩增导致的疾病进展。

2.2 RAS突变、BRAF突变

RAS/RAF/MEK/ERK是EGFR重要的下游通路之一，其发生突变或异常激活均可以导致EGFR-TKIs耐药。Eberlein等[35]对奥希替尼耐药的PC9和/或NCI-H1975细胞系进行耐药机制检测，发现神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物(neuroblastoma RAS viral oncogene homolog,NRAS)E63K突变，野生型NRAS及鼠类肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat Aarcoma viral oncogene homolog,KRAS)拷贝数的增加；同时发现奥希替尼与selumetinib (MEK抑制剂) 联合使用可以延缓或防止耐药性的发生。FLAURA研究[8]中显示BRAF突变占耐药机制的3%。研究[36]发现奥希替尼耐药后，BRAF V600E抑制剂Enorafenib (LGX818) 与奥希替尼联合使用可抑制耐药细胞的集落形成，但LGX818单药疗效较差。

2.3 PIK3CA突变、PTEN缺失

AURA和FLAURA研究均已证实PIK3CA突变是奥希替尼的耐药机制之一，已知的耐药突变大致包括：E545K、E453K、E542K、R88Q、N345K、E418K和H1047R，其中以E545K最具代表性，发生频率为4%[8-9, 26-27, 37-38]。PIK3CA突变可与HER2、MET以及EGFR等突变同时出现，但当同时存在时患者的PFS缩短，是较差的预后因素。PTEN基因可以负向调控PI3K/AKT信号通路，当其功能丧失时可通过增加PIP-3[磷脂酰肌醇-(3，4，5)-三磷酸]，导致AKT过度激活，最终产生耐药性。To等[39]的实验提示罗格列酮-氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR γ)激动剂可以增加PTEN的表达并抑制AKT的激活、诱导PTEN缺失的细胞自噬，从而对吉非替尼增敏。根据以上研究，推测PPARγ激动剂可以减少第三代EGER-TKI耐药的发生。

2.4 FGFR信号通路

Kim等[28]对奥希替尼耐药的患者肿瘤组织进行检测，观察到局部的FGFR1扩增和碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF2) mRNA的表达增加；同样，在建立的相应的HCC4006AR1-2细胞(747～749氨基酸缺失且对奥希替尼耐药性的NSCLC细胞)中，也发现FGFR1和FGF2mRNA表达水平高于亲本细胞；此外，这些细胞表现出对选择性FGFR1抑制剂 (PD173074和BGJ398) 的敏感，然而，FGF2的补充剂在EGFR突变的NSCLC细胞中则对奥希替尼具有耐药性。

2.5 细胞表型转化及治疗策略研究进展

2.5.1 细胞类型转化 Lee等[40]在21例晚期EGFR突变型肺腺癌中选取符合条件的4例患者，并对其在不同时间点获取的肿瘤组织进行测序，结果表明视网膜母细胞瘤基因(retinoblastomal,RB1)和p53的完全失活与小细胞肺癌的转化相关，并在克隆早期即以分化出来，且载脂蛋白Bm RNA编辑酶突变，催化多肽样诱导在小细胞转化分支中为常见突变。Ham等[41]的病例报道中两名非吸烟、奥希替尼治疗后肺腺癌转化为小细胞肺癌的女性患者，在经过依托泊苷联合卡铂的治疗后，肿瘤明显缩小。但基因测序显示这两名患者并没有出现RB1的丢失。这一发现与之前的结论相左，提示我们需要进一步的研究来更好地理解此种耐药机制。Roca等[42]汇总了肺腺癌患者经EGFR-TKIs治疗后出现肺鳞癌转化的病例，分析显示至肺鳞癌发病的中位时间为11.5个月，而诊断鳞癌后中位生存期为3.5个月。至今尚未有治疗转化鳞癌有效的报道。

2.5.2 上皮间质细胞转化(epithelial mesenchymal transition,EMT) EMT已被多个研究证实为EGFR-TKIs的耐药机制之一，分子层面主要为上皮细胞连接蛋白E-cadherin等的减少或消失、间质标记物波形蛋白等的增加。EMT使得TKIs耐药的机制大致为[43]：1)肿瘤微环境通过释放TGF-β、细胞因子等介导EMT效应导致耐药；2)信号通路介导EMT效应导致耐药，如：SRC信号通路、Notch信号通路、Hedgehog信号通路、Hippo信号通路、IGF1R信号通路等；3)表观遗传调控EMT导致耐药，如：DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰等。Weng等[44]研究发现JMF3086(组蛋白脱乙酰化酶和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶双重抑制剂)可以逆转EMT恢复奥希替尼的敏感性。此外，一些细胞毒剂，如：顺铂、吉西他滨、依托泊苷、长春瑞滨对间充质表型的细胞敏感。

2.6 细胞周期基因改变及治疗策略研究进展

AURA3和FLAURA研究均已表明细胞周期基因的改变是奥希替尼耐药机制中的一种，其发生的频率分别为11%、12%，包括CCND1/2、CCNE1、CDK4/6扩增以及CDKN2A的丢失。研究[26]显示当细胞周期基因改变时，PFS更短，对比为4.4个月vs18.8个月。

2.7 致癌基因融合及治疗策略研究进展

AURA3、FLAURA研究表明致癌基因融合可能是第三代抑制剂奥希替尼的耐药机制，分别为：FGFR3-TACC3基因融合、NTRK1-TPM3基因融合、RET-ERC1基因融合、SPTBN1-ALK基因融合。另外已报道的致癌基因融合还包括[27,45]：CCDC6-RET、NCOA4-RET、TRIM24-RET、GOPC-ROS1、AGAP3-BRAF、ARMC10-BRAF、DOCK4-BRAF、Eps15-BRAF、GHR-BRAF、AGK-BRAF、ESYT2-BRAF、SALL2-BRAF、PLEKHA7-ALK、EML4-ALK、EGFR-FGFR1等。Piotrowska等[46]的研究显示奥希替尼与BLU-667(Ret抑制剂)联合使用可以在一定程度上克服CCDC6-RET融合带来的耐药性。Offifin等[47]指出当出现EML4-ALK基因融合时，奥希替尼与克唑替尼联合使用可以延缓疾病的进展。

2.8 BIM缺失多态性及治疗策略研究进展

Bcl-2样蛋白11简称BIM，是Bcl-2蛋白家族中的一种。研究表明低表达水平的BIM可使突变的肺癌细胞降低对EGFR-TKIs的敏感性，而BIM蛋白缺失多态性则可导致奥希替尼耐药。研究者[48]在PC-9细胞系中已证实组蛋白去乙酰化酶抑制剂-vorinostat与奥希替尼联合使用可以治疗此耐药机制。目前正在开展多种Bcl-2小分子抑制剂的研究，如[49]：ABT-199(venotclax)、ABT-737、ABT-263(navitoclax)。

2.9 AURKA的激活及治疗策略研究进展

极光激酶是一类丝氨酸/苏氨酸激酶家族，是控制细胞周期的重要酶，可分为A、B、C三种类型，其中AURKA可促进DNA修复、细胞迁移及侵入，从而导致肿瘤的发生及进展。AURKA可以被其上游非洲爪蟾驱动类似的蛋白2(Xenopus kinesin-like protein 2,XKLP2)的靶向蛋白(targeting protein for XKLP2,TPX2)的过表达激活，进一步导致EGFR-TKIs耐药。Shah等[50]的研究指出,无论体内外，AURKA抑制剂与奥希替尼联合使用均可以诱导细胞凋亡，协同抑制获得性耐药细胞的生长。进一步的探索表明，联合用药的有效机制可能为获得性耐药细胞通过将促凋亡机制的控制从单独的EGFR转移到EGFR和AURKA，进而来逃避EGFR的抑制。这一发现提示TPX2或许可以作为EGFR-TKIs和AURKA抑制剂联合治疗EGFR突变型肺腺癌患者疗效的生物标志物。

2.10 Src通路激活与整合素及治疗策略研究进展

Ichihara等[51]用PC-9/BRc1细胞系进行研究，结果表明，Src家族激酶(SFK)基因中的YES1的扩增可导致奥希替尼的耐药性；且发现同时抑制SFK/FAK和EGFR可能是一种有效的治疗EGFR突变肺癌的策略。在寻求最佳治疗方式时显示，奥希替尼与达沙替尼的联合治疗在抑制肿瘤生长方面是最有效的。Seguin等[52]发现整合素αvβ3可通过形成整合素-kras复合物导致EGFR-TKIs耐药，但目前整合素相关治疗仍在实验中。

2.11 AXL的激活及治疗策略研究进展

AXL是一种受体酪氨酸激酶，研究表明活化的AXL与EGFR、HER3在诱导奥希替尼耐药性方面存在相关性。在EGFR突变的NSLCL细胞中，通过激活AXL-AKT轴，下调SPRY4使得对奥希替尼产生耐药性，但是这一通路的确切机制尚不清楚。但研究[53]证实AXL抑制剂与奥希替尼在治疗初始或耐受阶段联合使用可增加肿瘤细胞对EGFR-TKIs的敏感性，从而减少肿瘤大小并延缓肿瘤的生长。

2.12 氧化供能途径的改变及治疗策略研究进展

在癌症中存在Warburg效应，即大多数癌症类型表现出增强的糖酵解。然而，目前学术界认为癌症细胞中的糖酵解不仅仅是一种通过ATP产生额外能量的机制，而是获得关键细胞成分所必需的途径。研究表明，奥希替尼可以有效抑制敏感细胞中的糖酵解，然而当肿瘤细胞对奥希替尼产生耐药时则会通过氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OxPhos)途径获取能量，此时细胞对OxPhos抑制剂的敏感性增加。体外实验证实[54]，OxPhos抑制剂与奥希替尼联合使用可以延缓或阻止耐药性的发生。但进一步的体内实验则宣告失败，这提示肿瘤微环境可能在这一过程发挥作用。

2.13 EPHA2过表达氧化供能途径的改变及治疗策略研究进展

EPHA2属于受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)中最大的家族，EPH RTK与其配体结合后，能够激活多种下游信号通路，包括RAS/MAPK、PI3K/AKT和RHO/RAC。EPHA2在EGFR突变型肺癌中高表达，并在EGFR-TKIs产生获得性耐药的EGFRL858R+T790M突变型细胞中进一步过表达，从而促进肿瘤的生长。EPHA2的小分子抑制剂ALW-Ⅱ-41-27能够有效降低奥希替尼耐药细胞的存活率。这一实验[55]结果提示EPHA2可能成为TKI耐药肿瘤的有效治疗靶点。

3 总 结

第三代EGFR-TKIs的耐药机制已有所研究，但仍存在大量未知的耐药问题，研究表明耐药机制因用药时机的不同而有所差异。虽然目前针对各种耐药机制已有临床及临床前相关药物研究，但因其具体疗效尚不清楚，导致患者耐药后下一步的治疗也尚无标准方案。因此探讨更加合理的用药时机、寻找更多的潜在耐药机制仍是未来肿瘤医学的主要研究方向，以期为患者制定出更加个性化、合理化的治疗策略。

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