杨梦晨 晏权 任明见 李鲁华 徐如宏

摘 要：小麦Puroindoline基因与小麦籽粒硬度及其产量性状密切相关。为揭示贵州省小麦品种（系）中与籽粒硬度相关基因的分布，本文利用小麦籽粒硬度基因Pina、Pinb和Pinb-2的3个特异性功能标记对140份小麦品种（系）进行分子标记检测，旨在为遗传育种中亲本选择提供参考。结果表明，在140份贵州小麦品种（系）中，Pina-D1和Pinb-D1基因位点Pina-D1a、Pina-D1b、Pinb-D1a和Pinb-D1b等位变异的频率分别为17.14%、25.00%、50.71%和21.43%;在Pinb-2位点上，10.00%的小麦品种含Pinb-2v2等位基因，87.86%的小麦品种含Pinb-2v3等位基因。3个位点基因型组合分析表明，在所检测的贵州小麦种质中共有8种基因型组合，其中2种软质麦基因型组合Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v2、Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3;4种硬质麦基因型组合（Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v2、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3、Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v2、Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3和2种混合型组合Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v2、Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v3），各组合分布频率分别为0.71%、8.57%、0.71%、4.28%、3.57%、7.85%、0.71%和2.14%。研究结果可为贵州小麦籽粒硬度的遗传改良提供参考。

关键词：小麦;籽粒硬度;等位变异;分子标记

Abstract：Puroindoline gene was closely related to the kernel hardness and yield-related traits in wheat. In order to reveal the distribution of genes related to grain hardness in wheat cultivars （lines） in Guizhou Province， In this paper， specific function of three kernel gene Pina， Pinb and Pinb-2 markers was identified with molecular marker in total of 140 cultivars （lines）in order to provide reference for parent selection in genetic breeding. The results demonstrated that among the 140 wheatcultivars （lines） in Guizhou， the frequency of Pina-D1 and Pinb-D1 gene locus Pina-D1a， Pina-D1b， Pinb-D1a and Pinb-D1b alleles were 17.14% ，25.00%， 50.71% and 21.43%， respectively.At the Pinb-2 locus， 10.00% of the wheat cultivars contain the Pinb-2v2 allele， and 87.86% of the wheat cultivars contain the Pinb-2v3 allele. The analysis of genotype combinations at three locus showed that there were  eight genotype combinations in the tested wheat germplasm in Guizhou，including two soft wheat genotype combinations  （Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v2，Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3），four hard wheat genotype combinations （Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v2，Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3，Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v2，Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3） and two hybrid combinations （Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v2，Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v3），the distribution frequency of each combination is 0.71%，8.57%， 0.71%，4.28%，3.57%，7.85%，0.71% and 2.14%. The results could provide a reference for genetic improvement of grain hardness in Guizhou wheat.

Keywords：Guizhou wheat; grain hardness; allelic variation; molecular markers

目前，全球每年的小麥（Ttiticnm aestivum L.）产量大约为700万吨[1]。籽粒硬度是小麦重要品质性状之一[2]，根据小麦籽粒的硬度一般将小麦分为硬质麦和软质麦两类[3]。小麦籽粒硬度由位于5D染色体短臂上的Pina和Pinb基因[4-6]共同作用控制。当Pina和Pinb同为野生型（Pina-D1a/Pinb-D1a）时，籽粒为柔软表型，两者任何一个基因发生突变或缺失都会使籽粒变硬[7]。早期Pina和Pinb的鉴定大多采用SDS-PAGE电泳[8]，但Pina和Pinb的同源性高（约60%），分子量非常接近，用SDS-PAGE电泳很难区分，因此国内外学者相继开发出了Pina和Pinb基因型的分子标记，如Pina-D1a[9]、Pina-D1b[10]、Pinb-D1a和Pinb-D1b[11]等。陈锋等[12]通过籽粒硬度测定，随机选取了10个中国冬小麦软质麦品种进行了分子标记检测，结果表明其Pina和Pinb基因均为野生型，即Pina-D1a/Pinb-D1a，基因型与表型相符，证明已开发的分型标记可靠。王化敦等[13]测定了105份小麦的籽粒硬度，得出了40份硬质麦，再通过分子标记检测，发现它们是Pina蛋白缺失类型（即Pina-D1b/Pinb-D1a和Pina-D1b/Pinb-D1b），证实了已开发的籽粒硬度基因分子标记特异性强、准确性高。因此，上述研究中开发的功能标记已经能够对Pina和Pinb的多种类型进行有效鉴定。

近年来，与Pinb序列高度相似（约60%）的Pinb-like genes（也称为Pinb-2）基因与表型的相关性成为了研究热点[14]。Chen等[15]设计了Pinb-2的特异引物，得出Pinb-2v2和Pinb-2v3互为一对位于7B的等位基因。研究表明，Pinb-2v3变异类型的小麦品种在千粒重、小穗数、粒长、粒宽和等性状略高于Pinb-2v2[16];具Pinb-2v3的小麦品种与具有Pinb-2v2的小麦品种相比，有更高的籽粒硬度和更好的籽粒性状[17]。

目前，对贵州小麦材料Pina、Pinb、Pinb-b2基因分布的研究未有报道，鉴于Puroindoline基因与小麦品质性状和产量性状密切相关，且目前已开发的功能标记已经能够对Puroindoline各类型进行有效鉴定。本研究以3个籽粒硬度基因（Pina、Pinb和Pinb-b2）的特异性功能标记对140份贵州小麦品种（系）进行了分子标记检测，旨在为今后研究不同Puroindoline基因型对小麦加工品质的影响作用提供依据，进而有助于贵州小麦籽粒硬度的改良。

1 材料与方法

1.1 材料

材料：贵紫1号、贵农19、贵绿、黔育21、贵麦14、兴育89等140份贵州小麦品种（系），由国家小麦改良中心贵州分中心提供。材料名称及来源见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

取小麦幼苗叶片0.2g左右，采用改良CTAB法提取基因组DNA[18]。用Genova Nano型核酸蛋白检测仪（英国Jenway）检测DNA浓度后，稀释至100ng/μL，在4℃冰箱保存备用。

1.2.2 PCR扩增

提取后的基因组DNA在BIO-RAD T100_Thermal Cycler上进行PCR扩增，反应体系为20μL，以100ng小麦材料DNA为模板，1UTaq DNA Polymerase，10pmol的上游、下游引物，0.2mmol/L dNTP，10×PCRBuffer（含20mmol/L Tris-HCL（pH8.4）、20mmol/LKCL），25mmol/LMgCl2，剩下的用ddH2O补充至20μL。试验所需试剂购置于北京天根生化科技有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应特异性引物的序列及具体反应程序见表2。

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测及结果统计

PCR扩增产物用浓度为1.0%～1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测分析，所用缓冲溶液为0.5×TAE，在100～130V电压下电泳40～50min，用蒸馏水漂洗1min后，用UVP凝胶分析系统观察、照相并记录。

统计方法：根据每个材料的检测结果判断该品种Pina、Pinb和Pinb-2基因位点的等位变异类型，仅对PCR产物条带清晰、单一并符合目标条带大小的对进行统计。

2 结果与分析

2.1 贵州小麦品种（系）Pina基因等位变异分布频率

利用引物Pina-D1a和A-Null对供试小麦材料进行分子标记检测，分别能扩增出大小为447bp和326bp的片段，对应的等位变异类型为Pina-D1a和Pina-D1b（图1、2）。140份贵州小麦材料Pina位点的检测表明（表3），分枝麦5号、贵麦2号、丰优48-5、贵农优质麦、节普1号等24份材料扩增出447bp的目标条带，是Pina-D1a类型等位变异;贵紫1号、兴育89、贵麦1号、R21-2等35份材料扩增出326bp的目标条带，是Pina-D1b类型等位变异;其他材料未扩增出任何条带，即未含Pina-D1a和Pina-D1b基因的类型。在Pina位点，140份贵州小麦品种（系）中的优势等位变异为Pina-D1a类型，占比25.00%。

2.2 贵州小麦品种（系）Pinb基因等位变异分布频率

利用引物Gly和Ser对供试小麦材料进行分子标记检测，均能扩增出大小为240bp的片段，对应的等位变异类型为Pinb-D1a和Pinb-D1b（图3、4）。140份贵州小麦材料Pinb位点的检测表明（表3），丰优5号、贵农19无芒、丰优48-5、贵农28-1、等71份材料扩增出240bp的目标条带，是Pina-D1a类型等位变异;贵麦9号、贵麦2号、贵农25-1、安2014-4等30份材料扩增出240bp的目标条带，是Pinb-D1b类型等位变异;其他材料未扩增出任何条带，即未含Pinb-D1a和Pinb-D1b基因的类型。在Pinb位点，140份贵州小麦品种（系）中的优势等位变异为Pinb-D1a类型，占比50.71%。

2.3 貴州小麦品种（系）Pinb-2基因等位变异分布频率

利用引物Pinb-2v2和Pinb-2v3对供试小麦材料进行分子标记检测，分别能扩增出大小为401bp和398bp的片段，对应的等位变异类型为Pinb-2v2和Pinb-2v3（图5、6）。140份贵州小麦材料Pinb-2位点的检测表明（表3），丰优5号、丰优8号、贵农25-1、兴育89等14份材料扩增出401bp的目标条带，是Pinb-2v2类型等位变异;贵农35、石无芒、张07-8、贵农22等123份材料扩增出398bp的目标条带，是Pinb-2v3类型等位变异;其他材料未扩增出任何条带，即未含Pinb-2v2和Pinb-2v3基因的类型。在Pinb-2位点，140份贵州小麦品种（系）中的优势等位变异为Pinb-2v3类型，占比87.86%。

2.4 贵州小麦品种（系）Pina、Pinb和Pinb-2多个位点等位变异分布频率

在140份贵州小麦品种（系）中，Pina、Pinb和Pinb-2基因位点Pina-D1a、Pina-D1b、Pinb-D1a、Pinb-D1b、Pinb-2v2和Pinb-2v3等位变异的频率分别为17.14%，25.00%，50.71%，21.43%，10.00%和87.86%。组合分析表明，140份贵州小麦品种（系）中共存在8种不同等位变异组合，即Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v2、Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v2、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3、Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v2、Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3、Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v2和Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v3，分布频率分别为0.71%，8.57%，0.71%，4.28%，3.57%，7.85%，0.71%和2.14%（表4）。

3 结论与讨论

小麦籽粒硬度对出粉率、面粉颗粒大小和面制品加工品质影响很大，是重要的小麦品质性状之一[20]，明确小麦籽粒硬度基因Pina、Pinb和Pinb-2的等位变异类型分布特点，对于小麦品质改良具有重要意义。刘红美[21]、张晶[22]等发现黄淮麥区小麦核心种质和陕西小麦中的软质麦占比较低，硬质麦占比较高，硬质麦主要由Pinb-D1b基因型组成;国外的小麦品种（系）也以硬质麦为主[23-24]。而陈锋等[25]发现硬质小麦材料在西南地区的分布频率较低，李式昭等[26]的研究也表明，四川小麦品种中硬质麦占比较少。经检测，本试验140份供试的小麦品种（系）中Pina-D1a、Pina-D1b、Pinb-D1a和Pinb-D1b等位变异的频率分别为16.46%，25.32%，50.00%和21.52%，据此可分出籽粒硬质33份，软质13份，表明贵州小麦品种（系）中20.89%为硬质材料，8.23%为软质品种。其中，籽粒硬质及软质的小麦品种都较少，这一点与黄淮麦区和国外小麦的研究结果不同，与李式昭和陈锋等[26-27]的研究基本一致，小麦品种籽粒硬度分布的差异可能是自然地理环境和选育品种所选用的亲本资源不同所致。

Puroindoline基因的类似基因Pinb-2对食品加工品质和产量性状都有影响[27]。研究表明，具有Pinb-2v3等位变异类型的小麦品种其千粒重、籽粒直径、穗粒数、穗粒重和单株粒重等产量性状都较好[28]，且Pinb-2v3等位变异在国内外小麦品种中分布广泛[19，29，30]。本试验中，有124份材料检测出了Pinb-2v3，占比88.61%，Pinb-2v3具有很高的分布频率，与前人的研究一致。这可能是由于含Pinb-2v3的小麦材料其产量性状表现较为优异，育种家们在育种过程中不经意的选择了携带该基因的品种，致使大部分研究的调查品种中Pinb-2v3基因型最常见。对140份贵州小麦品种（系）的Pina、Pinb和Pinb-2多个位点基因型分布进行组合分析，得出2种软质麦基因型组合和4种硬质麦基因型组合。值得注意的是，组合Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3和Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3，在140份供试材料中作为优势组合的同时还含有与高千粒重相关的Pinb-2v3基因，今后可优先考虑利用具这些组合的材料进行贵州小麦品质育种的研究。

相较其他地区，贵州小麦品种（系）中，硬质、软质以及与高千粒重相关的品种较少，这进一步说明了贵州小麦品种在品质改良方面还有很大的提升空间。因此，本研究明确了140份贵州小麦品种（系）籽粒硬度的基因型，可为今后这些贵州小麦品种（系）籽粒硬度的改良和产量的提高提供帮助。

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