马小双 张锐乖 李文艳

摘要：研究了草果挥发油β-环糊精包合物的最佳制备工艺条件并考察其表征和稳定性。先用水蒸气蒸馏法提取草果挥发油，以提取率为指标，用正交试验选出最佳提取工艺条件。用饱和水溶液法进行草果挥发油的包合，以β-环糊精为壁材，以包合率和包合产率为指标，通过正交试验，优选草果挥发油最佳的包合工艺条件。使用薄层色谱法（TLC）、紫外分光光度法（UV）和显微成像法对包合效果进行了评价，并考察了包合物在强光、高温、高湿环境下的稳定性。结果表明：优草果挥发油提取条件为蒸馏时间6h、液比1：8、浸泡时间1.5h。最佳草果挥发油包合工艺条件为草果挥发油与β-环糊精体积比为1：10、包合温度为40℃、包合时间为1.5h、β-环糊精与水的体积比为1：10。通过用TLC、UV和显微成像法表征分析后，形成草果挥发油β-环糊精包合物，并通过稳定性考察，其具有一定的杭光照性、热稳定性、湿稳定性。试验得出的最佳提取挥发油工艺和草果挥发油包合工艺操作简便，提取率高，包合物稳定性好。

关键词：草果;挥发油;β-环糊精;包合物;稳定性

中图分类号：S576 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）22-0198-06

1 引言

草果（Amomumtsaoko）又名草果子《小儿卫生总微论方》，为姜科豆蔻属（AmomurnRoxb）植物草果（A.tsaoko Crevostet Lemarie）的干燥成熟果实[1]。主产于广西、云南、贵州等地，主要化学成分为挥发油、柠檬醛、樟脑油、α-松油醇、香叶醇和橙花叔醇等，具有燥湿健脾、温胃止痛和止呕截疟的功能，用于寒湿内阻、脏腹胀满、呕逆和不思饮食等症[2]。其中，挥发油中的1，8-按油素具有驱风、镇静、抗菌、抗病毒、杀灭寄生虫及发汗作用;柠檬醛具有平喘、祛痰和抑菌的作用;樟脑油具有刺激神经，使头脑清醒灵活的作用;α-松油醇、香叶醇、橙花叔醇有明显的镇静和抗菌作用[3]。草果挥发油具有独特的香味，可以作香料使用，广泛用于食品、化妆品和香精香料中[3]。草果作为香料，挥发油为其最主要活性成分，2015版《中国药典》把测定挥发油总量作为评价草果品质的重要指标。

国内对草果挥发油的提取工艺[4～6]、化学成分[7，8]、药理作用[9，10]等的研究比较广泛，但有关草果挥发油β-环糊精包合物制备的相关文献比较少也不全面，而对其他草本植物挥发油包合物制备的文献比较多。刘宇等[11]对油樟叶挥发油β-环糊精包合物的制备工艺进行了研究及稳定性考察，采用饱和水溶液法制备包合物，进行正交试验，以包合产率和包合率为筛选指标，优选出最优包合工艺。裴贵珍等[12]对孜然挥发油β-环糊精包合物的制备与评价。李颖[13]等用星点设计-效应面法优化鱼腥草挥发油-β-环糊精包合物的制备工艺。

国外有关课题组[14]运用水蒸气蒸馏法从草果挥发油中鉴定出了73种成分，主要成分为1，8-按油素、ρ-对丙基苯甲醛、香叶醇、香叶醛、α-松油醇、α-水芹烯、橙花醛、橙花叔醇、β-蒎烯等。国外有关课题组在前期工作中已采用水蒸气蒸馏法和GC-MS技术分离鉴定了广西草果挥发油的成分，且与以往的国内外相关研究报道相似，但在化合物含量和部分化合物类型上有所差异。这种差异有可能是由于草果的采集地点、提取方法以及果型的不同所造成的。而本试验选用云南马关县的草果，属于文山特色品种，国内外都没有相关文献研究报道。

中药挥发油疗效显著，但在传统中药剂型的制备过程中并未得到关注，利用环糊精包合技术可达到增加挥发性成分的溶解度和溶出度、提高其生物利用度及稳定性、固体化和降低毒副作用等目的[15]。尤其适用于中药挥发油的制剂研究，目前，表征药物β-环糊精包合物的方法较多，可分别从热分析、光谱学、色谱学等方面的性质差异对其进行验证[16，17]。β-环糊精有很好的水溶性和稳定性，草果挥发油经β-环糊精包合后，为白色固体粉末，使草果挥发油中浓烈的气味基本被掩盖，且包合工艺操作简便，挥发油利用率高。

2 实验仪器与试剂

2.1 材料与试剂

材料：云南马关县草果、β-环糊精。

试剂：无水乙醇、正已烷、乙酸乙醋、香草醛、硫酸、蒸餾水、自来水等。

2.2 仪器与设备

200g手提式高速万能粉碎机：DFT-200型，温岭市林大机械有限公司;电子调温电热套：DZTW型;北京市永光明医疗仪器有限公司;电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司;循环水真空泵：SHZ-DⅢ;巩义市予华仪器有限责任公司;恒温鼓风干燥箱：DGG-9240A型;上海齐欣科学仪器有限公司;超声波清洗机：WF-250EH型;薄层点样器：SP-Ⅱ型，上海科哲生化科技有限公司;紫外可见分光光度计：T9型，北京普析通用仪器有限责任公司;照相显微镜：DMO500型;药品稳定实验箱：云南特安呐制药股份有限公司;尼龙筛、挥发油测定器、圆底烧瓶、冷凝管、铁架台、量筒、烧杯、玻璃棒、布氏漏斗、抽滤瓶、冰箱、分析天平、硅胶G薄层板、展开槽、毛细管、密封玻璃瓶、称量瓶、移液管、吸尔球、保鲜膜等。

3 实验方法

3.1 草果挥发油的提取（水蒸气蒸馏法）

按《中国药典》2015年版一部附录挥发油测定法（甲法）进行口将干燥的草果粉碎，过2号筛，称取草果粗粗粉80.00g，置于1000mL圆底烧瓶中，选择蒸馏时间、料液比、浸泡时间3个因素进行L9（3³）正交试验，因素水平见表1。加入一定量的水，浸泡一定时间，连接挥发油测定器分别进行不同时间的蒸馏，精确读取挥发油的量[4]。

试验根据采用3因素3水平进行正交试验L9（3³），如表1。

3.2 草果挥发油β-环糊精包合物的制备

3.2.1 操作方法

选择草果挥发油与β-环糊精的配比、包合温度、包合时间、β-环糊精与水的比例4个因素进行L9（3⁴）正交试验，因素水平见表2。取β-环糊精适量，加蒸馏水配置成饱和溶液，置于恒温水浴锅上，搅拌的同时滴加草果挥发油，设定一定的搅拌时间，搅拌结束后，将形成的包合物混悬液置冰箱冷藏24h后，抽滤，弃去滤液，用15mL水乙醇洗涤包合物3次，直到无油渍，抽干后用恒温鼓风干燥箱50℃干燥，最后得到白色粉末状包合物。

3.2.2 包合物中实际含油量测定

包合率及包合物产率的测定，按《中国药典》2015年版一部附录挥发油测定法（甲法）进行。精密量取草果包合物，置于500mL圆底烧瓶中，加入蒸馏水300mL，连接挥发油测定器，使沸腾2h左右，直至油量不再增加后停止加热，放置至室温，读取挥发油实际含油量。并计算包合产率和包合率。

包合产率（%）=W包合物/（Wβ-环糊精+W挥发油）

包合率（%）=（包合物中实际含油量）/（挥发油加入量×空白回收率）

综合评分=包合率×80%+包合产率×20%

3.2.3 空白回收试验

精密量取3份挥发油1mL，分别置于500mL圆底烧瓶中，按“3.2.2”项下方法测定，分别读取油量，算出空白回收率。挥发油空白回收率=收集挥发油量/加入挥发油量×100%。

3.2.4 验证试验

取草果挥发油3份，按筛选出的最佳的包合工艺制备草果挥发油与β-环糊精包合物，对其制备工艺进行验证。

3.3 草果挥发油β-环糊精包合物表征研究

3.3.1 薄层色谱法

取草果挥发油1mL，用适量无水乙醇溶液溶解作为样品工;同理，取包合物适量按药典法提取挥发油，作为样品n;取包合物和β-环糊精各1g，用无水乙醇溶液20mL溶解，作为样品Ⅲ和Ⅳ;将样品点于硅胶G薄层板上，用正已烷，乙酸乙酯（17：3）为展开剂展开，以5%香草醛硫酸溶液为显色剂，烘干显色[11]。

3.3.2 紫外分光光度法

用精密移液管取草果挥发油1mL，用10mL无水乙醇稀释溶解，即样品溶Ⅰ;称取1g包合物，用10mL无水乙醇超声溶解15min，过滤，取上清液，用10ml容量瓶定容，即样品溶液Ⅱ，称取1gβ-环糊精，与样品溶液Ⅱ的处理方法相同，即样品溶液Ⅲ;将草果挥发油与β-环糊精物理混合，加入10mL无水乙醇超声溶解15min，与样品溶液Ⅱ的处理方法相同，即样品溶液Ⅳ。将草果挥发油、包合物、β-环糊精、草果挥发油与β-环糊精混合物四个样品在紫外分光光度计中进行200～800nm全波长扫描，观察吸收曲线变化[18]。

3.3.3 显微成像法

称取未研磨的β-环糊精、研磨的β-环糊精、包合物、草果挥发油和β-环糊精混合物各一定的量制成溶液，分别滴于载玻片上，用显微镜观察其成像并捕捉照相[18]。

3.4 草果挥发油包合物的稳定性考察

3.4.1 光稳定性试验

分别称取草果挥发油β-环糊精包合物、按照制备投料比混匀所得的草果挥发油与β-环糊精的混合物各3份，每份3g，置于称量瓶中，放于药品稳定实验箱均照射10d（强度4000Lx），于第0、5、10d时取样，按“3.2.2”项下方法测定挥发油相对含量[11]。然后所测得的挥发油含量/包合物（混合物）中挥发的原含量，得出包合物与混合物中草果揮发油的含量百分比。

3.4.2 高温试验

分别称取草果挥发油β-环糊精包合物、按照制备投料比混匀所得的草果挥发油与β-环糊精的混合物各3份，每份3g，置于称量瓶中，放于60℃恒温干燥箱内放置10d，于第0、5、10d时取样，测定挥发油相对含量[11]。

3.4.3 高湿试验

分别称取草果挥发油β-环糊精包合物、按照制备投料比混匀所得的草果挥发油与β-环糊精的混合物各3份，每份3g，置于称量瓶中，放在温度为25℃相对湿度为75%的药品稳定实验箱中。于第0、5、10d时取样，按“3.2.2”项下方法测定挥发油相对含量[11]

4 实验结果与分析

4.1 草果挥发油提取结果与分析

根据“3.2.2 "项下方法提取草果挥发油结果如表3，从表3中可以看出：A₃>A₂>A₁，B₂>B₃>B₁，C₃>C₁>C₂;提取工艺条件为A₃B₂C₃，确定草果挥发油最佳提取工艺条件：蒸馏时间为6h;料液比为1：8;浸泡时间为1.5h。极差R值R_A>R_C>R_B，确定各因素对草果挥发油提取率的影响主次顺序依次为A>C>B，即蒸馏时间>浸泡时间>料液比。

4.2 草果挥发油包合的结果与分析

4.2.1 饱和水溶液法正交筛选结果

包合草果挥发油正交的筛选，从表4中可以看出：A₃>A₂>A₁，B₁>B₃>B₂，C₂>C₃>C₁，D₁>D₂>D₃;草果挥发油的包合工艺条件为A₃B₁C₂D₁，即直观分析结果，确定草果挥发油包合物最佳的包合工艺条件为草果挥发油：β-环糊精为1：10;包合温度为40℃;包合时间为1.5h;β-环糊精：水为1：10。极差R值R_A>R_C>R_D>R_B，各因素对草果挥发油包合物包合的影响主次顺序依次为A>C>D>B;即草果挥发油：β-环糊精>包合时间>β-环糊精：水>包合温度。

4.2.2 空白回收试验结果

读取3份草果挥发油油量分别为0.80mL，0.85mL，0.90mL，挥发油空白回收率为85.00%。

4.2.3 验证试验结果

3份草果挥发油的包合率分别为58.74%，56.24%，52.65%;包合得率分别为66.54%，60.21%，64.82%，结果表明，该挥发油的包合工艺条件稳定，具有重现性和可操作性。

4.3 草果挥发油包合物表征结果与分析

4.3.1 薄层色谱法

草果挥发油（Ⅰ）、包合后提取的挥发油（Ⅱ）、包合物（Ⅲ）以及β-环糊精（Ⅳ）的TLC色谱图如图1所示。由图1可看出，样品Ⅰ和样品Ⅱ在相同的位置上出现了相同颜色的斑点，且Rf值基本相同，样品Ⅲ和样品Ⅳ中没有斑点出现，表明草果挥发油包合物已经形成，其表面并无挥发油残留，而且包合前后草果挥发油主要的化学成分未见明显的变化，所以包合物质量较好，说明包合过程对挥发油成分无影响。

4.3.2 紫外分光光度法

草果挥发油（Ⅰ）、包合物（Ⅱ）、β-环糊精（Ⅲ）及草果挥发油与β-环糊精混合物（Ⅳ）的UV谱图如图2所示。由图2可看出，样品Ⅱ和Ⅲ溶液无草果挥发油的特征吸收峰，而样品工和W溶液在相同位置上有草果挥发油类似的吸收峰，说明草果挥发油已经被β-环糊精包合在疏水性空腔结构中，已经构成一种新的物质。

4.3.3 显微成像法

β-环糊精（Ⅰ）、研磨后β-环糊精（Ⅱ）、包合物（m）及草果挥发油和β-环糊精混合物（Ⅳ）的显微成像图如图3所示。由图3可看出，未研磨β-环糊精和研磨后β-环糊精为无色半透明立方体状结晶颗粒，颗粒粒度相对较大且清晰可辨，而草果挥发油β-环糊精包合物为黑色不透明不规则团状物质，草果挥发油和β-环糊精混合物为半透明立方体状结晶颗粒。试验表明β-环糊精仅在外力作用下并未发生变化，而β-环糊精包合草果挥发油后，其形态颜色均发生改变，显示新物质已经形成。

4.4 稳定性考察结果与分析

4.4.1 光稳定性试验结果

光稳定性试验结果见表5，由表5可知，在强光下照射10d，测定草果挥发油β-环糊精包合物和混合物在不同取样时间的样品挥发油含量，结果表明，草果挥发油β-环糊精包合物和混合物中的挥发油含量都有所下降，但混合物中的挥发油含量下降快速，草果挥发油β-环糊精包合物的抗光解性明显优于混合物。

4.4.2 高温试验结果

高温稳定试验结果见表6，由表6可知，在60℃恒温干燥箱内放置10d，测定草果挥发油β-环糊精包合物和混合物在不同取样时间的样品挥发油含量，结果表明，草果挥发油β-环糊精包合物和混合物中的挥发油含量都有所下降，但混合物中的挥发油含量下降明显，草果挥发油β-环糊精包合物的抗高温性明显优于混合物。

4.4.3 高湿试验结果

高湿稳定性试验结果见表7，由表7可知，在温度为25℃相对湿度为75%的药品稳定实验箱中放置10d，测定草果挥发油β-环糊精包合物和混合物在不同取样时间的样品挥发油含量，草果挥发油β-环糊精包合物和混合物中的挥发油含量都有下降趋势，但混合物中的挥发油含量下降趋势明显，草果挥发油β-环糊精包合物的抗高湿性明显优于混合物。

5 结论与讨论

因揮发油具有易挥发、易升华、不稳定的特点，故不宜单独用于中药制剂，将其制成包合物以克服上述缺点。草果挥发油具有抗氧化、调节胃肠功能、抗菌、抗肿瘤以及改变药物通透性等作用，但稳定性较差，对光敏感，强光下易分解。将草果挥发油制成包合物后，可减少挥发油的挥发，使其挥发油的稳定性提高。

本试验是按《中国药典》2015年版一部附录挥发油测定法（甲法）进行，用水蒸气蒸馏法提取草果挥发油，选择蒸馏时间、料液比、浸泡时间3个因素进行L9（33）正交试验，以提取率为指标，选出最佳提取工艺条件。试验结果，最优草果挥发油提取条件为蒸馏时间6h、料液比1：8、浸泡时间1.5h，用水蒸气蒸馏法提取的草果挥发油提取率可高达2.50%左右，3个因素中蒸馏时间是主要因素，浸泡时间次之，最后是料液比。

将提取好的草果挥发油用β-环糊精（β-CD）包合，包合方法为饱和水溶液法，用正交试验优选最佳工艺，以挥发油包合率、包合物产率为评价指标。最佳草果挥发油包合条件为：草果挥发油与β-环糊精体积比为1：10，包合温度40℃;包合时间1.5h;β-环糊精与水的体积比为1：10。最终草果挥发油的包合率可到达55.87%左右，包合物得率可到达63.85%左右，各因素对草果挥发油包合物包合影响的主次顺序依次为草果挥发油：β-环糊精>包合时间>β-环糊精：水>包合温度。通过用薄层色谱法（TLC）、紫外分光光度法（UV）和显微成像法表征分析后，表明草果挥发油包合物已经形成，其表面并无挥发油残留，而且包合前后草果挥发油主要的化学成分未见明显的变化，所以包合物质量较好。并通过稳定性试验，即将草果挥发油β-环糊精包合物和混合物在光照、高温、高湿条件下放置一段时间，测定草果挥发油β-环糊精包合物和混合物在不同取样时间的样品挥发油含量。试验结果表明，草果挥发油β-环糊精包合物和混合物中的挥发油含量都有所下降，但混合物中的挥发油含量下降快速，而草果挥发油β-环糊精包合物的挥发油含量下降缓慢，其草果挥发油β-环糊精包合物稳定性明显优于混合物，具有一定的抗光照性、热稳定性、湿稳定性，以达到增加药物溶解度、稳定性，提高生物利用度的目的。

本试验的客分子为草果挥发油，具有较强的挥发性。经β-环糊精包合，将草果挥发油制成包合物后，使液态油状草果挥发油改变成固体粉末的包合物，便于配方，还可具有缓释作用。避免了挥发油挥发，增强了其稳定性，同时因为β-环糊精的特性，又使其在水中的溶解度增加，从而提高了其生物利用度。而提取草果挥发油的原料为云南文山马关县的草果，马关县具有发展草果产业的天然优势，种植的草果质量好。草果挥发油的用途广泛，用β-环糊精包合草果挥发油，使其挥发油的稳定性提高，提高了云南草果的经济效益和社会效益。

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收稿日期;2019-10-11

作者简介：马小双（1982-），女，讲师，硕士，研究方向为中药资源的开发与应用。