徐悦青 陈恒玲 林显光

摘要：指出了秀丽隐杆线虫是一种有节律性运动的生物，其中排便行为就是一种简单的节律性行为。这种简单性活动过程的执行需要基因和细胞的精确表达和调控。对秀丽隐杆线虫排便的活动过程的执行、周期的产生和调制，以及环境因素的影响进行了简单的综合性阐述。主要是从基因突变体上去分析了它们之间的作用及影响。

关键词：排便;节律性;线虫

中图分类号：Q959.174 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）22-0190-03

1 引言

秀丽隐杆线虫的学名为Caenorhahditis elegans，简称C.elegans。属于线形动物门、线虫纲动物。秀丽隐杆线虫本身和自然状态下与人类的关系不大，它生活在世界各地的泥土中，以细菌为食，容易人工养殖，对人、动物和植物没有危害。秀丽隐杆线虫非常小，成虫只有1mm左右，结构简单、身体透明、易于观察、繁殖周期短等生物学特征，因此它可以作为模式生物[1]。秀丽隐杆线虫排便行为是一种生物性马达作用的结果，也称排便运动程序（DMP）。它是由外周环境因素和内在的感觉调控，如温度、食物和机械刺激等。DMP是由三组不同的收缩肌肉组成。DMP根据肌肉执行的功能过程不同分为三个步骤：第一步是躯干后体壁肌肉收缩过程（pBoc），第二步是躯干前体壁肌收缩过程（aBoc），最后一步是肠肌肉收缩（EMC），将肠内容物的排出体外过程（Exp）。并且DMP具有类似于时钟的属性，具有规律性，周期性。通常排便的周期以时间长度去计算，连续两个pBocs之间的时间距离为一个周期。在正常条件下（20℃的温度），成虫排便大约56s激活一次[2]。

2 DMP的执行

DMP的执行具有两个明显的特点：步骤性和周期性。因此就会思考这些问题：它是怎样去执行这种周期性并且是怎样去协调各个过程的。为了了解这一点，将首先回顾一下它的三步过程，特别关注的是在它们之间作用的信号是由那些基因表达调控的，因此这可能涉及行为协调的不同方面。

2.1 pBoc突变体

pBoc的这一步是目前研究最少的一步。在目前研究中，只发现了一个产生特定缺陷的pBoc的基因egl～8，它编码磷脂酶Cβ的同源物[3]。egl-8突变体也有其他的行为缺陷，如产卵缺陷，这可能与基因产物作用于调节神经肌肉接头处的乙酞胆碱的释放有关。从pBoc表型缺陷体中可以看出egl-8是表达在肠细胞中，并且在后肠细胞中表达最强。这个与pBoc的信号直接由后肠发起相一致，因此cgl-8是协调DMP实施作用的关键基因。

2.2 aBoc突变体

aBoc缺陷突变体分为两种：一种是只影响aBoc过程的abo突变体，另一种是同时影响aBoc和exp的过程的axe突变体[4]。这些突变体往往具有普遍的神经系统缺陷，经常表现运动缺陷。aex-1编码C2结构区域蛋白，这种蛋白调节突触小泡的释放[5];aex-3编码ARab3-GTP酶的鸟嗓嘌呤换因子（GEF），通过在突触前RAB-3调节囊泡释放的作用，并通过不同的途径作用于新的蛋白CAB-1[6];aex-5编码一个呋喃类前激素转化酶。基于遗传证据表明，aex-5似乎与aex-1作用相同的途径。aex-1转基因表达在肠道中，可以拯救突变体的aex-1的表型。而aex-1转基因表达在肌肉组织中，可以挽救突变体的其他神经传递的缺陷。在突变体肌肉中表达aex-5也可以挽救一些aex-5突变体的神经传递缺陷，但它不能拯救它的表型缺陷。肌肉或肠道中的活性aex-5以一种分泌肽信号去调节突触小泡的释放的，并且aex-1可能也参与到这种作用于肠道的信号通路。

2.3 Exp突变体

已鉴定出大量的Exp突变体。这些突变体可以分为下列四类。

第一类突变体会产生神经传递的缺陷。其中fat-3编码D6-去长链酶，这种酶是合成长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFAs）所必需的酶。fat突变体表现exp过程的缺陷。fat-3突变体已被证明与突触囊泡的耗尽和胆碱能，5-羟色胺能神经肌肉接头的神经递质异常释放有关[7]，它们同样可以通过减少GABA能神经传递来影响肠肌的收缩。

第二类突变体表现出半显性的Exp。由功能突变获得表型，如突变体表现出与体壁或咽肌（或两者）相关的额外肌肉缺陷。同时这些突变体也有一些产卵缺陷（EGL）。研究表明这些基因可能是作用于肌肉或者影响肌肉的兴奋作用。egl-30可能也属于这一类，分析表明，虽然egl-30在一些肌肉中表达，但它主要也是在神经系统中表达，在那里它起调节突触释放的作用。目前尚不清楚它的排便表型的作用部位是在肌肉还是在神经系统中[8]。

第三类突变体会产生神经递质r-氨基丁酸（GA-BA）有关的缺陷。产生Exp缺失表型的突变体表现出GABA生物合成、转运或突触前释放的异常缺陷，还可能表现出DVB和AVL向GABA能神经元的异常分化。虽然在大多数情况下，GABA是抑制性神经递质，通过激活选择性阴离子通道介导抑制作用。肠道肌肉缺乏GABA与通过激光消融去除AVL和DVB导致肠道兴奋性缺乏的效果是一样的，表现出GABA在该系统中起兴奋性神经递质的作用。

第四类突变体是那些具有肠肌发育的缺陷的突变体。肠肌是指两块肠道肌肉（IM），括约肌和肛门减压肌（AD）。它属于线虫的小肌肉。例如hlh-8突变体编码一种进化保守的环螺旋（BHLH）的转录因子，这种转录因子在中胚层模式形成中具有进化保守的作用，hlh-8突变体也表现出Exp过程的缺陷。dsc-1突变体具有多层次排便功能缺陷，包括Exp缺陷。编码配对同源异型核转录因子dsc-1的突变体在的AD和IM中表达exp-1，这个恢复exp-1表达可以挽救dsc-1突变体的Exp缺陷[9]，表明dsc-1表型的缺陷可能很大程度上归因于exp-1表達的丧失。因此dsc-1可能是这些肌肉的终端分化所必须的。因此，筛选具有exp缺陷的突变体可能是一种富有成效的为鉴别这种独特的肌肉分化所需的基因的有效方法。

3 周期的产生与调制

目前为止所引起的最大的关注点是排便行为的节律性与细胞内钙振荡和下游信号作用关系的研究。合并的遗传学，钙成像和生理学研究使它成为一个独特的强大的Ins（1，4/5）P3依赖性钙信号在非兴奋细胞中调控的分子机制模型。

3.1 肠内钙瞬变

排便周期，定义为两个连续的pBocs之间的时间长度。在肠上皮细胞中它是由Ins（1，4/5）P3相关的钙的振荡控制。Dal Santo等人通过将钙敏感染料FurA-2注射到线虫完整的后肠，产生的自发肠内钙振荡水平与排便周期的长度的频率一致，且钙振荡水平是在pBoc启动前的达到肠道的高峰。ins（1，4，5）p3受体是一种定位于内质网由itr-1编码的钙释放通道，钙振荡在ins（1，4，5）p3受体功能缺失突变体中减慢甚至消失。相反，itr-1的过表达产生长周期缩短。分析表明，尽管itr-1是在多种细胞类型中表达，但是也通过在肠内细胞表达调节周期排便。肠内的ins（1，4，5）p3依赖性钙振荡不仅控制排便速度，而且也能直接控制后壁肌肉的收缩，还可以通过分泌因子的方式激活控制前壁肌肉和肠肌收缩的神经回路。

3.2 Ins（1，4/5）P3调制

尽管itr-1在调节排便率方面起着关键作用，但已有大量的突变株被证明可以调节排便率。然而，只有少数这些基因似乎是通过直接作用Ins（1，4/5）P3信号来实现的。Ins（1，4，5）P3是由磷脂酶C（PLC）介导的磷脂酞肌醇（4，5）-二磷酸-PTDIN（4，5）P2水解生成的。秀丽隐杆线虫有六个plc编码基因，其中就有两个基因egl-8（PLCB）和plc-3（PLCG）影响排便周期长度。这些基因无论是RNA干扰还是功能丧失突变，都会导致周期长度增加。周期长度和肠道内明显的钙振荡失常有关。基于对itr-1功能增强突变和ins（1，4，5）p3激酶和磷酸酶（分别由lfe-2和ipp-5编码）功能丧失突变的上位性分析，似乎就像由plc-3而不是egl-8产生的ins（1.4，5）p3直接调节itr-1一样。因此，它egl-8分子仍然是可能的通过其他的分子而不是直接通过Ins（1，4，5）P3在排便循环中起作用。另一个itr-1的上游调节因子是vav-1编码的vav家族的鸟嗦岭交换因子（GEF）。vav-1突变体导致排便周期不规则。遗传上位性分析表明vav-1通过rho/rac GTP酶ced-10、mig-2和rho-1和ppk-1（磷脂酞肌醇4-磷酸5激酶）在肠内调节ins（1，4，5）p3信号。在其他系统中，vav-1已经被证明作用于PLCr的上游，所有这些基因都有可能作用于同一途径。

3.3 脂质代谢调节

在肠道中，对脂肪酸延伸酶基因elo-2进行RNA干扰表达，会导致排便周期缩短。这可能是由在突变体中棕榈酸的积累引起的。elo-1编码脂肪酸伸长酶的突变体，fat-2和fat-3编码脂肪酸去饱和酶的突变体，都会导致排便周期延长和不规则，可能是因为突变体中缺乏特定的长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFAs）。dsc-4编码线虫微粒体甘油三酯转运蛋白（MTP）的突变体，也导致缩短排便周期长度，这可能是肠道中缺少所需要脂类的分泌[10]。所有这些突变体可能通过改变它们的脂类组成影响肠道细胞的某些特性，可能是影响细胞膜或内膜的结构功能，依次影响INS（1，4/5）P3介导的信号传导。

3.4 肌肉调节

dsc-1突变体即表现Exp的缺陷又表现周期长度的改变。与上述其他周期长度突变体相比，dsc-1仅在AD和IM中起作用，而不在肠道中起作用。Exp缺陷似乎仅能部分解释dsc-1的周期长度缩短的原因。正如已经描述过的其他Exp突变体，如unc-43功能获得性突变体，缺乏肠肌收缩导致肠内食物充盈，最终导致一个有力的肠内容物的排出，形成一个或两个更长的周期。然而，在dsc-1突变体中两种缺陷似乎是可分离的，因为拯救了Exp缺陷仅部分挽救周期长度改变。这让人联想到一个flr-4等位基因（ut7）突变体可通过外源性氟释放拯救Exp缺陷，而不影响周期长度的缺陷[11]。同时dsc-1的过表达与野生型相比，周期长度增加。因此，可能有一种从肌肉到肠的反馈调节机制，有助于协调肠内产生的钙信号和各种肌肉类型的定时收缩。在这种反馈机制中dsc-1可能是肌肉活动所需要的。值得关注的是外源性5-羟色胺加快排便率，但是还没有明确5-羟色胺对周期长度的影响。

3.5 能量代谢调制

另一组有排便时间缺陷的突变是那些在行为和发育特征的时间上有普遍缺陷的突变。一些突变体表现出“Clk”表型（包括生物钟的异常功能），其中包括减慢产蛋、咽泵，排便行为率，胚胎和胚胎的后期发育，衰老等特征[12]。这些tpk-1，clk-1，isp-1突变体影响能量代谢。tpk-1编码硫胺素焦磷酸激酶（TPK）这是一种硫胺素（维生素B1）转化成具有生物活性硫胺素焦磷酸（TPP）所必需的酶，其中TPP是大量的生物合成和代谢酶必不可少的辅助因子。clk-1编码泛醌生物合成所需的羟化酶（UQ，也称辅酶Q，COQ），泛醌是一种与细胞内氧化还原反应有关的预先酞化泛酿脂类，最重要的是作为线粒体呼吸链中电子的转运体。isp-1编码线粒体呼吸链复合体Ⅲ的rieske硫铁蛋白。目前还不清楚突变体它们各自功能的中断导致Clk表型，猜测可能与这些突变体影响能量代谢有关。

4 循环的环境调节

4.1 温度的调节

在大多数情况下，线虫的所有生理速率都是温度依赖性，也包括排便率。野生型个体在20℃生长当转移到15℃时，周期长度显著增加，当转移动到25℃时，周期长度显著降低。这种调整发生得很快，当野生型线虫在被转移到25℃，周期长度在记录几个小时后变短。因此，排便周期似乎没有温度补偿，与其他一些不受温度的影响的生物节律不同。然而，有一些突变体揭示了溫度补偿机制在该系统中起作用。当clk-1突变体从20℃转移时到25℃或从20℃到15℃时，周期长度没有变化。这些突变体揭示了存在温度对排便周期影响的机制。

4.2 食物的调节

已经有实验证明，除了温度之外，食物也调节周期长度。当食物（大肠杆菌）浓度降低时，周期长度会增加。在完全没有食物的情况下DMP很少被激活。然而，咽泵率和排便率之间似乎没有直接关系，这表明食物对循环长度的影响可能不是反馈的结果。从肠扩张的程度来看，反而可能是感觉输入所致。钙/钙调素依赖的丝氨酸/苏氨酸激酶Ⅱ型（camk Ⅱ）似乎参与了这种感觉输入过程，因为unc-43编码c.elegans camkⅡ）的功能缺失突变体在缺乏食物的情况下继续激活该感觉输入程序[3]。有趣的是，外源性5-轻色胺增加了排便率也会增加咽部的泵送速度这可能是食物对周期长度的影响由5-羟色胺介导。

5 结语

对排便行为的认识目前还不是很清楚。但是秀丽隐杆线虫的排便行为的机制逐步被发现。从排便行为的结构分析到排便过程的解析，以及过程中神经（AVL和DVB），肌肉、递质、神经肽等的相互作用关系正一步一步被发现。因此这种节律性排便行为可以作为一个系统来研究基因功能和解决有关节律性行为和排便机制的基本问题。对神经系统功能、肌肉的基础发育，非兴奋性细胞中的钙信号的认识，是认识生命活动的基础。秀丽隐杆线虫的排便可以作为一个生物模型，用于研究人类便秘的机制，也可以作为生物节律性的生物模型，研究人类的生物节律性如昼夜节律。上面提到的众多的研究中，发现了排便缺陷突变体的多样性，即使在这样简单的系统，也需要许多不同的细胞和整体共同协调同一个过程。在秀丽隐杆线虫排便中尽管取得了一些进步，但仍存在许多问题。对于广泛的排便基因表达，准确识别他们在哪里，他们在排便中所扮演的角色将帮助我们了解各种组织和分子反馈机制。许多突变体都有被证明有周期长度缺陷，但很少有电生理实验进一步去验证。因此，无论起点是钙振荡、肌肉兴奋性、GABA神经递质传递、能量代谢或温度补偿，都是揭示动物行为表达所必需的所有因素的过程。

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收稿日期：2019-09-29

基金項目：中央高校基本科研业务费专项资金项目（编号：CZP17069;CZY18029）

作者简介：徐悦青（1992-），女，硕士研究生，研究方向为生物医学工程学。

通讯作者：林显光（1980-），男，副教授，博士，研究方向为神经生物学。