李季蓉 杨红 刘晓辉 姜慧明 李林翰

摘要：采用苏丹黑B染色法从大连龙湖湿土壤中地分离获得5株可产油真菌。经形态学鉴定，分别是土曲霉（Aspergillus terreus）、淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）、毡状枝顶孢（Acremonium kiliense）、朱黄青霉（Penicillium minioluteuin）、橘黄青霉（Penicillium aurantiogriseurn）。采用酸熱法破碎细胞、甲醇—氯仿法进行了油脂的提取并计算，确定其中土曲霉产油率最高，产油率为47.6%。

关键词：湿地;筛选;产油真菌

中图分类号：Q939 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）22-0180-03

1 引言

随着全球社会经济的发展和人类对自然资源的开发利用，石化资源已经成为关系到各国经济发展的重要资源[1]，包括微生物油脂资源在内的生物能源开发已经成为世界各国的研究热点[2～4]。微生物生长具有生长周期短、可再生、易发酵培养等特点而备受关注，早期国外研究者就从灰绿青霉（Penicillium glaucum）抱子中抽提出7%的脂肪[5]，截至目前已有部分微生物的油脂产物已在食品领域得以应用[6]。本文通过从湿地土壤环境中分离获得不同种类真菌菌株中筛选出具有产油能力的丝状真菌，并对其产油率进行测定，为微生物能源开发提供重要生物资源。

2 材料与方法

2.1 试验材料

样品采集：通过5点取样法从大连龙湖湿地土壤中取样，将采集的样品装到无菌的离心管（50mL）中带回实验室，4℃冰箱保存，48h内分离完毕。

试验中使用的主要试剂：孟加拉红培养基粉（MEA）;马铃薯土豆琼脂培养基粉（PDA）;限氮培养基：葡萄糖40g，硫酸铵2g，磷酸二氢钾7g，磷酸氢钠2g，酵母粉1g，硫酸镁1.5g，1000mL水;苏丹黑B、甲醇、氯仿等。

2.2 试验方法

2.2.1 真菌菌株的分离纯化

采用稀释分离法在MEA培养基上培养5～10d，尽可能多地分离获得可培养的丝状真菌，再用PDA培养基对各个菌株进行纯化培养。

2.2.2 产油丝状真菌筛选及油脂提取

将分离纯化的种菌株接人限氮培养基内，于28℃180r/min的恒温摇床上培养5d后，收集菌体以备用。将离心后得到的菌球用滤纸过滤后轻压风干，取菌体浸于苏丹黑B染液中10min，再用95%酒精漂洗，至使滤纸呈现白色，观察菌体颜色，若带有蓝黑色则说明带有脂类物质。记录菌株代号及菌体染色颜色程度。

2.2.3 油脂提取及产油率的计算

产油菌株在限氮培养基中培养7d，采用酸热法将真菌细胞破碎[7]。破碎的真菌细胞液利用甲醇一氯仿法抽提油脂，液体中加入10ml，甲醇和10ml.氯仿，充分震荡后于常温，5000r/min下离心10min，取出下层氯仿层，向其中加入等体积的0.1%的氯化钠溶液，混匀，离心，取出氯仿层。将氯仿层溶液置于旋转蒸发仪上旋转蒸发蒸去除氯仿，于105℃烘1h，冷却后即得油脂，称重。

产油率=油脂质量/菌体干质量×100

2.2.4 产油真菌的鉴定

观察真菌菌落颜色、生长速度、质地等特征，同时显微镜下观察真菌抱子形状、颜色、产孢结构、菌丝分隔等特征，查阅相关真菌鉴定文献，对产油真菌进行形态分类地位鉴定。

3 结果与讨论

3.1 湿地真菌分离及产油真菌的初筛

通过稀释培养法从采集的样品中共分离纯化出35个菌株，经限氮培养基发酵培养后，菌体经苏丹黑B然后烘干后，得到5株产生深色脂类物质的真菌，菌株标号分别为Y-1，Y-5，Y-8，Y-13，Y-19，具体染色结果如图1～5。

3.2 5株产油真菌产油率比较

如图6所示，5株真菌产油率差别较大，其中土曲霉产油率最高47.6%，其次是朱黄青霉22%。淡紫拟青霉、毡状枝顶抱和橘黄青霉产油率分别为17.6%、14.5%，而橘黄青霉产油率最低，仅为6.1%。

3.3 5株产油真菌的形态鉴定

经形态学观察鉴定，5株可产油真菌分为是Y-8土曲霉（Aspergillus terreus），Y～19淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）、Y-5毡状枝顶抱（Acremoni-um kiliense）、Y-13朱黄青霉（Penicilliumminiolute-um）、Y-1橘黄青霉（Penicillium aurantiogriseum），如图7。

本文从湿地土壤中分离获得的1株产油率较高的丝状真菌土曲霉（Aspergillus terreus），为微生物油脂资源开发提供重要菌种资源，同时也将对该菌株的发酵优化条件及产油机理展开进一步深入研究。

参考文献：

[1]王萍，张银波，江木兰，等.多不饱和脂肪酸的研究进展[J].中国油脂，2008，33（12）：42～46.

[2]林粤顺，景旭东，周红军，等.微生物油脂研究进展[J].仲恺农业工程学院学报，2015，28（3）：66～70.

[3]易绍金，郑义平.产油微生物的研究及其应用[J].中外能源，2006（2）：90～94.

[4]Patricia S，Berndha R.Rainer K， et al.A sensitive，viable colonystaining method using Nile red fordirect screening of bacteria thataccumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage com-pounds[J].ArchMicrobiol，1999（171）：73～80.

[5]Hockenhaull D T D.Progress in industrial microbiology[J].Hey-wood of Company LTD，1959（1）：191～208.

[6]黄建忠，施巧琴，周晓兰，等.深黄被抱霉高产脂变株的选育及其发酵的研究[J].微生物学通报，1998（4）：187～191.

[7]林义，钟添华，骆祝华，等.尼罗红染色法筛选产油酵母及定量检测胞内油脂含量的研究[J].微生物学通报，2012，39（1）：125～137.

收稿日期：2019-10-31

基金项目：国家自然科学青年基金项目（编号：31800007）;大连民族大学创新训练项目（编号：201812026063）

作者简介：李季蓉（1997-），女，大连民族大学环境与资源学院学生。

通讯作者：杨红（1978-），女，副教授，博士，研究方向为真菌分类。