刘晓辉 吕国忠 杨红 李季蓉 李林翰 王剑钊

摘要：试验研究了平枝构子（Cotoneaster horizontalis）、苍耳（Xanthium sibiricum）、花椒（Zanthoxylum bun-geanum）3种植物粗提物对玉米弯孢菌（Curvularia lunata）、向日葵菌核（Sclerotinia sclerotiorum）、人参灰霉（Botrytis cinerea）、人参黑斑（Alternaria panaz）、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、辣椒疫霉（Phytophthoraca psici）6种植物病原菌的抑菌活性。结果表明：平枝构子和苍耳粗提物对6种病原菌均有较好抑菌效果，其中平枝构子和苍耳对人参灰霉菌抑菌活性较明显，抑菌率分别为89.87%和83.54%。花椒除对人参灰霉有一定的抑菌效果外，对其它5种病原菌均存在一定程度上的促生长作用。

关键词：植物粗提物;抑菌活性;病原真菌

中图分类号：S482.2 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）22-0177-04

1 引言

植物病害是造成农业生产作物损失的重要原因之一，而真菌是引起各类植物病害的重要病原物之一。目前为了提高作物生产力和质量，农业生产依然无法摆脱对化肥和农药的依赖[1]。近年来，西方国家已经禁止大量使用合成农药，因其具有高毒性、急性毒性、需要长期降解期、毒素在食物链中累积等问题，过度使用和滥用农用化学品对环境造成了严重的污染，随着人们环保意识和食品安全意识的提升，人们对安全、有效的农药替代品需求日益增加[2]，而植物源抑菌农药已经成为目前的研究热点。本试验以平枝构子、苍耳、花椒果实粗提物为研究对象，对生产上常见6种作物病害：玉米弯抱菌叶斑病、向日葵菌核病、人参灰霉病、人参黑斑病、瓜果腐霉病和辣椒疫霉病的病原菌的抑菌作用展开研究，为后期活性物质的分离提纯提供理论基础。

2 材料与方法

2.1 供试材料

平枝栒子果实采集于大连民族大学校园内，采集后装入无菌袋中带回实验室并清洗处理，4℃冰箱保存[3];花椒和苍耳果实购买于学校附近药店。

供试植物病原菌：玉米弯抱菌（Curvularia luna-ta）、向日葵菌核（Sclerotinia sclerotiorum）、人参灰霉（Botrytis cinerea）、人参黑斑（Alternaria panax）、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、辣椒疫霉（Phytoph-thora capsici）6种植物病原菌均由沈阳农业大学真菌实验室提供。

2.2 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）用于活化菌株及其他供试病原真菌的活化和抑菌活性测定。

2.3 主要仪器及试剂

DHG-9147A电热恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司;KG-SX-500蒸汽灭菌器：KAGOSHI-MA SEISAKUSYO INC;EV923MF7-NRH微波炉：广东美的厨房电器制造有限公司;C21-SDHCB39电磁炉：浙江苏泊尔股份有限公司;VS-1300L-U超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司：RH62K6151S8/SC冰箱：苏州三星电子有限公司;RXZ-280B智能人工气候箱：宁波江南仪器厂;ME203E/02电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司等。

无水乙醇、蒸馏水、石油醚、冰醋酸、土豆、葡萄糖、琼脂等。

2.4 试验方法

2.4.1植物粗提物的制备

分别称取研磨成粉末状的苍耳、平枝构子、花椒果实各200g于500mL三角烧瓶中，每个瓶中分别加入200mL去离子水、200mL石油醚200mL无水乙醇，用封口膜密封且做好标记后放入120r/min转速的摇床内，震荡3d（见表1）[4]。每个处理5个重复。

3d后将混合液分别用纱布过滤到棕色收集瓶内并做好标记（标记见表1），同时将过滤后的固体残留物继续放回原三角瓶内，加入150mL原提取液以相同转速摇床震荡2d;2d后将各混合液分别用纱布过滤到相应棕色收集瓶内，同时将过滤后的固体残留物继续放回原三角瓶内，加入150mL原提取液以相同转速摇床震荡1d;1d后将各混合液按照上述方法分别提取到指定收集瓶内。3种植物浸提液分别放到旋转蒸发仪上旋转蒸发，去离子水设置温度80℃，无水乙醇设置温度70℃，石油醚设置温度40℃，得到膏状物称质量。用乙醇定容0.005g/mL，4℃冰箱低温保存。样品旋转增发后膏状物质量，见表2。

2.4.2 抑菌活性试验

用打孔器（直径0.5cm）在培养7～10d的植物病原菌培养皿内打孔，然后分别转入到混有植物粗提物（浓度为0.005g/mL）的培养基中并做好标记，设立对照组。菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%。

3 结果与分析

3.1 不同萃取溶剂对3种植物粗提物萃取率的影响

由表2可知：去离子水对苍耳的提取率最高，萃取率達到1.15%，乙醇次之，石油醚最低;乙醇对平枝栒子的提取率最高，萃取率达到1.01%，去离子水次之，石油醚最低;去离子水对花椒的提取率最高，达到1.185%，乙醇次之，石油醚最低。综合以上结果，本试验选择去离子水作为苍耳和花椒萃取溶剂，选择无水乙醇作为平枝栒子作为萃取溶剂。

3.2 抑菌活性鉴定结果

3.2.1 3种植物粗提物对玉米弯孢菌叶斑病菌的抑菌活性

由图1可知：去离子水萃取的苍耳粗提物和去无水乙醇萃取的平枝拘子粗提物对玉米弯孢菌有显著的抑菌效果，其中平枝栒子抑菌活性最好，达到75.34%;苍耳抑菌活性达68.49%;而去离子水萃取的花椒粗提物对玉米弯孢菌叶斑病菌没有抑菌活性，且试验中粗提物对玉米弯孢菌的生长有一定促进作用。

3.2.2 3种植物粗提物对向日葵菌核病菌的抑菌活性研究

由图2可知：无水乙醇萃取的平枝栒子粗提物对向日葵菌核病菌抑菌活性最好，达到81.69%;去离子水萃取的苍耳粗提物对向日葵菌核病菌抑菌率达到46.47%;而去离子水萃取的花椒粗提物抑菌效果为负值，即花椒内某些物质促进了向日葵菌核病菌的生长繁殖，促生长率达到16.9%。

3.2.3 3种植物粗提物对人参灰霉病菌的抑菌活性研究

由图3可知：无水乙醇萃取的平枝栒子粗提物抑菌活性最好，达到89.87%;去离子水萃取的苍耳粗提物抑菌率达到83.54%，略次于平枝栒子;去离子水萃取的花椒粗取物对人参灰霉有一定的抑菌活性，抑菌率为20.25%。结果表明：平枝栒子和苍耳的粗提物对人参灰霉生长有明显抑制活性，花椒粗提物对人参灰霉病菌抑菌效果不显著。

3.2.4 3种植物粗提物对人参黑斑抑菌活性研究

由图4可知：无水乙醇萃取的平枝栒子粗提物对人参黑斑病菌抑菌效果最好，達到73.01%;去离子水萃取的苍耳粗提物对该病菌的抑菌率为39.68%;而去离子水萃取的花椒粗取物对人参黑斑病菌有促生长作用，促生长率为15.87%。

3.2.5 3种植物粗提物对瓜果腐霉的抑菌活性研究

由图5可知：无水乙醇萃取的平枝栒子粗提物对瓜果腐霉菌抑菌活性达到69.81%;去离子水萃取的苍耳粗提物对该菌的抑菌率为52.63%;而去离子水萃取的花椒粗提物对瓜果腐霉无抑制作用，反而促进该菌生长，且促生率为52.83%。

3.4.6 3种植物粗提物对辣椒疫霉菌的抑菌活性研究

由图6可知：无水乙醇萃取的平枝拘子粗提物对辣椒疫霉有显著的抑菌效果，抑菌率达到75.00%;去离子水萃取的苍耳粗提物对该菌也有较显著抑菌效果，抑菌率达到65.38%;而去离子水萃取的花椒粗取物对辣椒辣椒疫霉菌存在促生长作用，且促生率达到了59.61%。

4 结论与讨论

植物次生物质的抑菌作用的研究是现阶段植物源抑菌农药开发的重要方向。本研究表明：平枝拘子和苍耳粗提物抑菌普遍较广，平枝拘子粗提物对6种植物病原菌抑菌率均达到69%以上，其中对人参灰霉病菌的抑菌率高达89%;苍耳对人参灰霉抑菌率达到83%以上。由此可见，以上2种植物中均含有一定的农用抗菌成分，可作为两种潜在的植物源农药开发资源对其稳定性、抑菌活性物质进行深入研究。

此外，研究中发现花椒除对人参灰霉病菌具有一定抑菌作用，对其它病原菌均有促进生长作用，对瓜果腐霉、辣椒疫霉菌促生长率达到50%以上。陆宁海等研究发现花椒在甲醇、乙醇、丙酮和二甲苯4种不同溶剂提取物对水稻纹枯病菌、番茄早疫病菌、大葱紫斑病菌和棉花枯萎病菌4种植物病原菌菌丝生长的抑制作用存在显著差异，其中甲醇的提取物抑菌活性最低[5]。而本研究中采用去离子水作为提取溶剂，其粗提物对所研究的参试6种病原菌中的5种具有促生作用，说明不同的溶剂提取的花椒粗提物的活性物质存在显著差异且复杂，需要根据生产实际选择合适的萃取溶剂，以便获得所期活性物质。本研究结果表明，从植物源生防抑菌活性物质角度，尽量避免使用去离子水作为花椒萃取溶剂，以减少促生成分对抑菌效果的不良影响。

参考文献：

[1]周汛，李桂明.10种中药的不同制剂对常见致病菌体外抗菌活性研究[J].中华中医药杂志，2009，24（2）：237～239.

[2]Bertschinger HU，Nief V，Tsch？ pe H.Active oral immunizationof suckling piglets to prevent colonization afterweaning by entero-toxigenic Escherichia coli with fimbriae F18[J].Veterinary Micro-biology，2000（71）：255～267.

[3]沈映君，陈长勋.中药药理学[M].上海：上海科学技术出版社，2012.

[4]梁宇，高玉葆.内生真菌对植物生长发育及抗逆性的影响[J].植物学通报，2000（1）：52～59.

[5]陆宁海，吴利民，侯培琳，等.不同溶剂提取花椒抑菌活性物质的初步研究[J].河南农业科学，2012，41（6）：109～111.

收稿日期：2019-10-15

基金项目：国家自然科学青年基金项目（编号：31800007）

作者简介：刘晓辉（1994-），女，硕士研究生，研究方向为真菌资源与分类。

通讯作者：吕国忠（1964-），男，教授，博士，研究方向为真菌资源开发。