邢 跃,李 雯,吕世存,李春娥,秦佳梅

(1.通化师范学院,通化134002；2.通化长白山药谷集团股份有限公司,通化134001）

暴马丁香是木犀科落叶灌木或小乔木，原产于中国，广泛分布于东北、西北、华北等地,朝鲜、日本、俄罗斯等国家也有分布[1]。以干皮入药称暴马子皮，含多种化学成分，其中紫丁香苷为暴马子皮的指标性成分[2]，具有调节机体免疫[3]、保肝[4]、抗炎[5]、降血压[6]、提高耐受能力[7]等药理活性，广泛用于药品、保健品、化妆品等领域。随着其市场的需求量逐年增大，树皮的大量剥取，导致暴马丁香树大量死亡，暴马丁香野生资源遭到严重破坏。为充分开发利用暴马丁香资源，本实验以暴马丁香枝条为供试材料，采用响应面法[8]优化暴马丁香枝条中紫丁香苷的超声提取条件。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2018年春采自吉林省白山市临江区、经通化师范学院植物教研室秦佳梅教授鉴定的暴马丁香[Syringa reticulata(Bl.)Hara var.amurensis(Maxim.)Hara]的枝条。剪成1～3cm小段，装入尼龙纱袋中晾晒，用FZ102型植物粉碎机粉碎，过40目筛，备用。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的建立

准确称量5mg紫丁香苷的标准品（江苏永健医药公司96.9%，纯度HPLC≥98）放置于50mL容量瓶中，加水定容得到浓度为100μg/mL的紫丁香苷标准液。准确移取 2.50、5.00、7.50、10.00、12.50mL 标准溶液分别放置于5个50mL容量瓶中[9]，以纯净水定容并摇匀，稀释100倍，使用UV-1000型紫外可见分光光度计，在265nm[9]波长条件下测定吸光度值，绘制紫丁香苷浓度与吸光度值关系的标准曲线，通过分析得到回归方程。

1.2.2 紫丁香苷含量测定

精确称取供试材料1g，以纯化水为溶剂配制成不同体积分数的乙醇，量取一定体积并浸泡1h,在不同功率下超声（KQ-300DE型数控超声波清洗器）提取一定时间，将提取液在转速为12000r/min的TGL-20bR高速冷冻离心机中离心25min，精密移取1mL上清液稀释100倍后，用紫外分光光度计在265nm波长下测定提取物的吸光度，并按下列方式计算含量：

含量（mg/g）=c×100×L/m×1000

式中：c为稀释后提取液中紫丁香苷的质量浓度，单位为μg/mL；

100为溶液稀释的倍数；

L为溶液定容的体积，单位为mL；

m为暴马丁香粗粉的质量，单位为g。

1.3 超声波提取暴马丁香中紫丁香苷单因素实验

通过参考相关文献资料[10],选取超声波提取法中对于紫丁香苷提取量有显著影响的4个要素因子,即料液比、乙醇浓度、超声功率、超声时间，研究各要素因子对暴马丁香中紫丁香苷提取率的影响。

1.3.1 料液比对暴马丁香中紫丁香苷提取的影响

按照1.2.2方法，设置乙醇浓度为45%、超声功率为 180W，超声时间为 45min，考察料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50g/mL）对暴马丁香中紫丁香苷提取率的影响。

1.3.2 乙醇浓度对暴马丁香中紫丁香苷提取的影响

在1.3.1考察料液比的基础上，设置超声功率180 W，超声时间为45 min，考察乙醇浓度 （15%、30%、45%、60%、75%）对暴马丁香中紫丁香苷提取率的影响。

1.3.3 超声波功率对暴马丁香中紫丁香苷提取的影响

在1.3.1、1.3.2考察料液比和乙醇浓度的基础上，设置超声时间为 45 min，考察超声功率（120、150、180、210、240W）对暴马丁香中紫丁香苷提取率的影响。

1.3.4 超声波时间对暴马丁香中紫丁香苷提取的影响

在上述考察优化料液比、乙醇浓度和超声功率的基础上，考察超声时间（30、45、60、75、90min）对暴马丁香中紫丁香苷提取率的影响。

1.4 响应面实验设计暴马丁香中紫丁香苷的多因素实验

在单因素实验结果的基础上,利用Design ExpertV8.0软件Box-Behnken响应面法的设计原理,设计三因素三水平的响应面法实验[11]，以乙醇浓度、超声功率、超声时间为自变量，紫丁香苷提取率为响应值判定最佳工艺条件,详见表1。

表1 紫丁香苷提取响应面实验设计因素水平编码表

2 结果

2.1 标准曲线的绘制

使用Excel对紫丁香苷浓度和吸光度值进行线性回归得标准曲线，图1所示。标准线性方程为Y=0.0457X+0.0133（R2=0.9993），表明紫丁香苷浓度在5μg/mL～25μg/mL范围内线性关系良好，可用于后续实验分析。

2.2 单因素实验结果分析

2.2.1 料液比对暴马丁香中紫丁香苷提取的影响

图1 紫丁香苷标准曲线

图2 料液比对紫丁香苷提取率的影响折线图

图3乙醇浓度对紫丁香苷提取率的影响折线图

图2 示暴马丁香中紫丁香苷提取率随着料液比的增大，呈现先增加后下降最后趋于平缓趋势。当料液比为1∶20时，暴马丁香中紫丁香苷提取率最高达2.08mg/g。这是因为随着溶剂的增多,暴马丁香粗粉与溶剂之间能充分接触,有利于紫丁香苷溶解于溶剂中，但当溶剂过多时导致物料吸附提取物能力增大，不利于待提取物的提取[12]。因此选择料液比 1∶20(g∶mL)作为提取暴马丁香紫丁香苷的条件。

2.2.2 乙醇浓度对紫丁香苷提取率的影响

图3表明暴马丁香中紫丁香苷提取率随着乙醇浓度的增大，呈现先增加后缓慢下降趋势。乙醇浓度较低时的变化当乙醇浓度为60%时，暴马丁香中紫丁香苷提取率最高达2.07mg/g。这是因为苷类是极性物质,易溶于水等极性溶剂中，紫丁香苷极性较高,更易溶解于水中。因此在乙醇体积分数较高的情况下,其提取率较低;因此选择乙醇体积分数45%～75%为进一步考察优化范围。

2.2.3 超声时间对紫丁香苷提取率的影响

图4 超声时间对紫丁香苷提取率的影响折线图

图5 超声功率对紫丁香苷提取率的影响折线图

由图4可知，暴马丁香中紫丁香苷得率随着超声时间的延长呈现先增加后下降趋势。当超声时间为60min时，暴马丁香中紫丁香苷提取率最高达2.253mg/g。这是由于提取时间增加，提取物溶解到溶剂的总量在不断增多，60min时,紫丁香苷已基本溶出,但时间过长会导致部分提取物发生氧化、结构被破坏等物理化学现象[13]，使得最后的提取率减小。因此选择提取时间45～75min为进一步优化范围。

2.2.4 超声功率对紫丁香苷提取率的影响

由图5可知，暴马丁香中紫丁香苷提取率随着超声功率的增大呈现先增加后缓慢下降趋势。当超声功率为180W时，暴马丁香中紫丁香苷提取率最高达2.269mg/g。

这是由于功率较低时,不足以使物料充分受到超声波的作用。功率为180 W时,紫丁香苷提取率最大,继续增大提取功率,对紫丁香苷具有破坏作用,为了进一步明确超声功率对暴马丁香中紫丁香苷的影响,选取超声功率在120～240 W之间进行优化设计。

2.3 响应面实验设计暴马丁香中紫丁香苷的多因素实验

2.3.1 响应面法设计方案及结果

在单因素实验基础上，利用Design-ExpertV 8.0软件中Box-Behnken响应面分析法进行设计。实验具体设置17个实验，中心实验5个，用以分析实验误差。析因实验12个。选取乙醇浓度(A)、超声时间(B)、超声功率(C)作为自变量,提取率作为响应值,进行响应面分析，详见表2。

表2 响应面实验分析设计及结果

2.3.2 回归方程及方差分析

以暴马丁香中紫丁香苷得率(Y)为响应值，经回归拟合，各影响因子与响应值的回归方程为：

Y=2.32+0.017A+0.014B-0.054C-6.000E-033AB+4.000E-033AC-0.021BC-0.13A2-0.093B2-0.0948C2

为检验所得方程是否有效，对拟合结果进行方差分析，结果见表3。通过分析结果可知，该拟合模型显著性较高，失拟项是用来评估方程可靠性的一个重要数据，结果显示失拟项P=0.7790＞0.05，失拟项不显著,表明方程拟合的比较好，可以很好地描述各个因素与响应值之间的真实关系。利用该方程可确定暴马丁香中紫丁香苷的最佳提取条件。影响大小的顺序是超声功率＞乙醇浓度＞超声时间。回归方程的相关系数R2=0.9431，进一步说明可以利用该模型来确定紫丁香苷超声提取的最佳提取工艺。

表3 回归方程的方差分析

2.3.3 响应面法分析

通过Design-Expert 8.0.6软件分析，提取暴马丁香枝条中紫丁香苷最佳条件为：乙醇浓度60.93%、超声功率为162.05 W、超声时间为61.57 min，该条件下紫丁香苷提取率为2.3259 mg/g。

为考察不同因素之间的交互作用，固定一个变量，将其他2个变量与紫丁香苷提取率的方程模型拟合为三维空间曲面图，结果见图4～6。

图4 乙醇浓度和超声时间对紫丁香苷提取率影响的响应面

图5 乙醇浓度和超声功率对紫丁香苷提取率影响的响应面

图6 超声时间和超声功率对紫丁香苷提取率影响的响应图

3 讨论

关于紫丁香苷的研究工艺大多实验材料为刺五加[14]，且多为正交设计法[12]，这类方法多为线性模型的设计实验,虽然实验次数少、数据易处理,但准确性不高[15]。以暴马丁香为实验材料的研究报道较少，本实验采用响应面分析法，利用回归方程将多个因子实验中因素之间的相互作用关系用多项式拟合,然后研究函数的响应面和等高线,分析因素与响应面之间、两个因素之间的交互关系。较好的处理离散的水平值及因素的交互作用，可更为精确的找到各因素间的最佳组合和响应值的最优化，且周期短、精度高[16]。

本实验考察液料比、乙醇浓度、超声功率、超声时间等因素对紫丁香苷提取率的影响，运用响应面法对乙醇浓度、超声功率、超声时间三因素进行交互优化分析，得到最佳提取工艺为：料液比1∶20，乙醇浓度60.93%,超声功率162.05W,超声时间 61.57min,该条件下紫丁香苷提取率为2.3259mg/g。