江连洲，冉安琪，贾子璇，刘季善，李 杨，王中江

不同贮藏期大豆蛋白对千页豆腐品质的影响

江连洲1，冉安琪1，贾子璇1，刘季善2，李 杨1，王中江1※

（1. 东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030；2. 山东万得福实业集团有限公司，东营 257000）

为了研究不同贮藏期大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）对千页豆腐品质的影响，该文首先研究了贮藏期对大豆分离蛋白结构的影响，进而探讨贮藏期对大豆蛋白制备千页豆腐的品质的影响。对不同贮藏期的大豆蛋白分别采用了凝胶质构特性、感官评价、羰基含量、大豆蛋白亚基以及巯基的测定，并采用拉曼光谱对大豆蛋白二级结构、二硫键构型以及侧链结构进行了分析，同时采用扫描电镜观察千页豆腐的微结构。结果表明：随着贮藏期的延长，千页豆腐的感官评价变差，由88分降低至44分；其凝胶网络结构逐渐疏松；大豆蛋白羰基含量逐渐上升；巯基含量逐渐下降；二级结构含量改变；凝胶硬度呈下降趋势，硬度值低于234 g时，将无法达到千页豆腐的质量要求。这表明在贮藏期内SPI发生了氧化，导致大豆蛋白质结构发生改变，使其凝胶性质下降。

贮藏；蛋白；农产品；千页豆腐；大豆分离蛋白；凝胶品质

0 引 言

大豆是中国主要农作物之一，其蛋白质含量丰富且必需氨基酸组成完整，是植物蛋白质的优质来源，大豆蛋白具有多种功能特性，被广泛应用于食品工业中[1-2]。谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase，简称TGase或TG酶）是一种催化蛋白质分子间或分子内形成~（~谷氨酰基）赖氨酸共价键的酶，可以催化蛋白质分子之间发生交联，将蛋白质分子黏合起来形成凝胶[3-4]。千页豆腐是SPI在TG酶作用下形成的凝胶，是近年来兴起的素食产品，具备特有的Q弹（口感脆且有弹性），极受消费者的喜爱[5]。千页豆腐的凝胶过程比较复杂，包括蛋白质空间结构的改变，基团与凝胶体系中离子及其他基团相互作用后形成凝胶，通过蛋白质分子链的展开，结合和聚集等几个历程，蛋白质的分子链得到了充分的伸展，相互交联形成三维网状结构，固定大量水分，从而形成凝胶。

在贮藏过程中，蛋白质极易发生氧化，蛋白质分子在活性氧或次生氧化产物作用下形成共价结构修饰，导致蛋白质功能性质及其营养品质下降[6-7]。大豆中富含脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）和多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），在加工过程中结构遭到破坏，LOX与PUFA直接接触，产生大量自由基和氧化产物，大豆蛋白发生结构性氧化修饰，使蛋白质结构发生显著变化，如主链断裂，分子交联，分子解折叠以及构象改变，进而影响大豆蛋白凝胶性质[8-10]。SPI贮藏期一般只有30 d，30 d以后的蛋白质在加工成千页豆腐的品质标准无法达到下游客户的需求。因此本试验探究贮藏期在30 d内SPI结构和功能的变化。

试验以不用贮藏期SPI的质构特性、电镜、拉曼分析等参数为指标，探究贮藏期对大豆蛋白结构和功能的变化以及对大豆蛋白制成千页豆腐的影响，为千叶豆腐的生产应用及产业化提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白（SPI）：选用刚分离出来的SPI产品（蛋白质89.21%，灰分0.50%）进行贮藏，贮藏期分别为：0、6、12、18、24、30 d，购置于山东万得福实业集团有限公司；谷氨酰胺转氨酶（TG酶）（酶活力为1 000 U/g），购置于泰州市一鸣生物制品有限公司；蛋白Marker（SM0431），购置于Fermentas Life Sciences公司；考马斯亮蓝R250，购置于天津市科密欧化学试剂厂；SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒，购置于北京索莱宝科技有限公司。所有其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

3205型博朗食品加工机，山东博科科学仪器有限公司；电子分析天平，上海精密仪器仪表有限公司；LLOYD TA1型质构分析仪，美国；PE Raman Station 400激光显微拉曼光谱仪，美国PE公司；BIO-RIA 电泳槽，BioRAD凝胶成像仪，美国Biorad公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大豆分离蛋白的贮藏

将购买刚生产的SPI采用PE 膜真空袋（10 cm×15 cm，最大氧气通过率为48 cm3/(m2·24 h)，最大H2O通过率6.86 g/(m2·24 h)）包装，置于4℃恒温箱中贮藏。贮藏时间为30 d，每隔6 d对SPI性质进行分析。

1.3.2 千页豆腐的制备工艺

制浆：冰水加入食品调理机内，加入0.67 g TG酶，低速搅拌30 s溶解；加入50 g SPI斩拌90s。缓慢加入33.33 g大豆色拉油后，高速斩拌1 min。加入食盐，高速斩拌1 min。

凝固：将浆液装入自封袋，尽快放入水浴锅内50 ℃凝固90 min。

蒸煮：取出后，及时放入80 ℃水浴锅内，蒸煮45 min。

冷却、包装、贮藏：取出后直接放到准备好的冰水中，快速冷却1 h，及时进行口感评价。冷却至室温后包装，于-18 ℃下贮藏。

1.3.3 千页豆腐的质构特性

采用LLOYD TA1型质构分析仪的质地剖面分析（TPA）模式对千页豆腐的质构进行测定[11]。指标有硬度、黏性、弹性、黏聚性、胶着性、咀嚼性和回复性。传感器选择为100 N，触发力为1 N，待测凝胶的厚度为9 mm，压缩比为70%，探头直径为25 mm，探头下降速度为2 mm/s，检测温度为室温，测定结果为3次测试的平均值。

1.3.4 感官评价测定

感官评价标准：由经培训的18～35岁感官评价人员按表1标准对产品进行感官评价[12]。

表1 感官评价测定标准

1.3.5 大豆蛋白凝胶拉曼光谱测试

试验所用的拉曼光谱仪是PE Raman Station 400激光显微拉曼光谱仪。拉曼光谱测定参照江连洲等[13]的方法，进行一定的修改，相关参数设定：发射功率80 mW，测量拉曼光谱范围为400～1 800 cm-1，激发光波长785 nm，曝光时间60 s，每个样品都重复扫描3次以上。扫描后各样品数据利用Origin 8.5软件进行平滑处理，采用Peakfit Version软件进行拟合分析。

1.3.6 大豆蛋白羰基含量的测定

蛋白质氧化程度主要利用Levine等[14]的羰基含量的测试分析方法进行测试。将样品分散于10 mmol/L的pH值7.0的磷酸盐缓冲液中（蛋白质浓度约为4 mg/mL），室温搅拌30 min使之充分溶解，然后在4 ℃、8 000条件下离心10 min，收集上清液，用双缩脲法测定上清液中蛋白含量。

用2 mol/L HCl 溶解2，4-二硝基苯肼（DNPH），最终浓度为10 mmol/L。取1 mL已知浓度蛋白上清液与3 mL含10 mmol/L的DNPH溶液混合，另取用2 mol/L的HCl代替10 mmol/L的2，4-二硝基苯肼溶液作空白对照，室温下避光反应2 h。然后分别加入4 mL 20%三氯乙酸混匀，静置20 min，在4 ℃、8 000条件下离心10 min，去除上清液，用5 mL体积比乙醇/乙酸乙酯（1∶1）清洗沉淀3次；然后将沉淀溶于3 mL含6 mol/L盐酸胍的0.1 mmol/L、pH值7.0磷酸钠缓冲液中，待沉淀充分溶解。

在367 nm处测定吸光值，以22 000 mol-1·cm-1为消光系数计算每mg蛋白质羰基衍生物的摩尔数。

1.3.7 大豆蛋白巯基及二硫键含量

大豆蛋白的总巯基基团，包括巯基（-SH）和还原的二硫键（-S-S-），其中巯基又包括游离的和埋藏在疏水基团内部的-SH。

总巯基含量的测定方法参考樊永华等用DTNB滴定的方法[15]。取400L SPI溶液溶于10 mL离心管中，加入20L巯基乙醇和1.6 mL尿素-盐酸胍溶液于25 ℃恒温水浴锅中静置1 h，5 000 r/min离心10 min，清洗沉淀2次。倒掉上清液后向沉淀中加入4 mL pH值7.0的0.1 M磷酸盐缓冲溶液和32L DTNB。于25 ℃恒温水浴锅中静置1 h，10 000 r/min离心30 min。取上清液在412 nm处测定吸光值412nm，每组样品测定3次。

游离巯基含量的测定依据Shimada等[16]的测定方法。取一定量的SPI溶液，稀释到10 mg/mL，取2 mL SPI溶液加入2 mL pH值8.0的磷酸盐缓冲溶液和67L DTNB，于25 ℃恒温水浴锅中静置1 h，10 000 r/min离心30 min，取上清液在412 nm处测定吸光值412nm，每组样品测定3次。

巯基含量计算公式如式（1）所示

巯基含量（mol/g）=73.53×412×/（1）

二硫键含量计算公式如式（2）所示

二硫键含量（mol/g）=（总巯基含量-游离巯基含量）/2 （2）

式中412为412 nm下的吸光度；为蛋白质浓度，mol/g；为稀释因子。

1.3.8 大豆蛋白亚基的SDS-PAGE电泳分析

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质组成，分离胶为15%，浓缩胶为5%。蛋白质量浓度为5 mg/mL，将样品煮沸90 s后上样，上样量为5L，电压为120 V，时间为1.5 h，电泳结束后考马斯亮蓝R250进行染色30 min，用甲醇-冰醋酸溶液进行震荡脱色，每30 min更换一次脱色液。使用BioRAD凝胶成像仪观察凝胶片，定性定量地分析样品的亚基组成[17]。

1.3.9 千页豆腐的微结构观察

依据Koo等[18]测定方法，略有修改。千页豆腐的微观结构用扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）测定。将制备好的SPI凝胶切成2 mm×5 mm×5 mm的小条，然后经过戊二醛固定，置于4 ℃冰箱1.5 h以上。再用磷酸盐缓冲溶液冲洗2~3次，每次10 min，冲洗后用50%、70%、90%的乙醇逐次脱水，最后用100%乙醇∶叔丁醇=1∶1和100%叔丁醇脱水各一次，每次15 min，冷冻干燥，切取干燥后的凝胶表面镀膜，用 JSM-6360LV 型扫描电镜在15 kV加速电压下观察其表面形态。

1.4 统计分析

所得数据均为3次重复的平均值，结果表示为平均数±标准差。ANOVA差异显著性分析利用SPSS V17.0软件完成，值小于0.05为显著性差异，采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 千页豆腐的质构特性

质构特性是决定凝胶的品质的重要特性。表2显示了千页豆腐的TPA结果：在贮藏前期，蛋白质分子堆积，轻微氧化使硬度值逐渐降低，而贮藏后期，氧化程度加剧，SPI分子中游离巯基被氧化，分子间作用力弱化，也导致SPI凝胶的硬度值降低。其中硬度值，胶着性值和咀嚼性值随贮藏期延长而逐渐降低，弹性值先降低后增加，黏聚性值和回复性值基本稳定不变。在千页豆腐形成的过程中，7S的亚基与11S的碱性亚基有选择地进行相互作用，并直接影响着大豆蛋白的凝胶性，11S蛋白质的酸性亚基对凝胶网状结构的形成具有重要作用，因此大豆蛋白的结构决定了其凝胶的形成过程[19]。SPI凝胶的凝胶强度及硬度变化规律与其二级结构相似，由此可推测，贮藏期内SPI二级结构的改变会进而影响其凝胶性质。基本确定以硬度值为主要的千页豆腐品质评价指标，模拟口感中黏聚性、弹性、回复性指标差异不显著。

表2 千页豆腐质构特性

注：同一列数据后不同字母代表差异显著（<0.05），下同。

Note: Different letters after the same column of data represent significant differences (<0.05), the same below.

2.2 千页豆腐的感官评价

按照1.3.4的方法进行感官评价的检测，结果见表3，感官评价分值逐渐降低。从表1检测的SPI凝胶的质构和感官评价相关指标来看，随着贮藏期的延长，千页豆腐在口感上从细腻、有一定的硬度逐渐变得粗糙、不爽滑硬度较差；在味道上由无异味变得有异味；在色泽上由正常白色变得无千页豆腐的正常白色、色泽不均；组织状态也变得表面粗糙、不平整；弹性也逐渐降低。

表3 千页豆腐感官评分

对于硬度值、咀嚼性与品质感官评价性有相关性，不能作为全部评价参考，经过12和30 d贮藏的SPI凝胶硬度值及咀嚼性接近，但在口感上韧性差距较大，这主要是由于韧性的表征不能用咀嚼性完成。千页豆腐感官评价结果与千页豆腐微结构（图5），质构特性（表2）相一致。硬度值与千页豆腐品质正相关，即硬度数值越大，感官评分越高，千页豆腐吃起来柔软又劲道、爽口不粘牙，可以客观反映千页豆腐质量。当硬度值大于234时，即可达到千页豆腐的质量要求。

2.3 贮藏期大豆分离蛋白的拉曼分析

2.3.1 二级结构分析

拉曼光谱中谱峰位置及强度的变化主要用于研究大豆蛋白二级结构及疏水微环境变化。蛋白质的酰胺Ⅰ带常被用于检测蛋白质的主链结构[20]。不同贮藏期SPI在波长400～2 000 cm-1的拉曼光谱如图1所示，相关特征峰根据已有研究[21]，指认如表4所示。

表4 大豆分离蛋白的拉曼特征峰位及峰位归属

图1 不同贮藏期对大豆分离蛋白拉曼扫描光谱的变化

由表5可知，随着贮藏时间的延长，-螺旋、-折叠和-转角构象含量呈先增加后降低的趋势，无规卷曲构象含量先降低后增加。在贮藏期0～18d期间，-折叠和-转角构象含量逐渐增加，无规卷曲构象含量逐渐降低。说明SPI在贮藏期间发生分子自聚集，SPI有序结构较多，蛋白质稳定性强。在贮藏期18～30 d期间，SPI因遭到氧化攻击而局部变性，-螺旋含量在逐渐降低，说明维持-螺旋结构的氢键遭到破坏，蛋白质分子的无序性也在增加，分子结构趋于暴露式，贮藏后期可能导致氧化断键[22]。无规卷曲含量明显增加，说明这与此状态下大豆蛋白亚基聚集行为有关，进一步表明SPI形成了氧化聚集，蛋白质分子结构展开程度降低[23]。氧化使SPI空间结构发生了变化，有序的二级结构向无序变化，形成氧化聚集体和共价交联物，导致大豆蛋白凝胶强度下降[9]。

表5 不同贮藏期大豆分离蛋白二级结构类型及含量

2.3.2 二硫键分析

为了探究不同贮藏期SPI二硫键类型的相对含量，我们运用 Peak Analyzer 软件进行多峰值 Guassina 拟合，结果如图2所示，计算结果如表6所示。随着贮藏期的延长，SPI中g-g-g构型和g-g-t构型含量先增加后降低，t-g-t构型含量则先降低后增加。在贮藏期24～30 d内g-g-g构型含量明显下降，表明蛋白质受到氧化攻击导致二硫键类型由分子内转变为分子间，蛋白网络逐渐疏松。随着贮藏时间的延长，-SH基团被脂肪氧合酶催化产生的脂质氢过氧化物部分氧化，进而使通过-SH/-S-S-交换反应形成的分子间二硫键数量降低[24]。

注：试验所得的拉曼谱线用红线表示；拟合得到的各条高斯谱线用蓝线表示。

Note: The Raman spectrum obtained from the experiment is represented by a red line; the fitted Gaussian spectrum lines are indicated by blue lines.

图2 不同贮藏期SPI拉曼谱带在500～550 cm-1区域内的高斯拟合图

Fig.2 Raman decomposition fitting of different storage periods SPI Raman bands in regions of 500-550 cm-1

2.3.3 侧链结构分析

760 cm-1附近的拉曼谱带归属为色氨酸侧链，对于观察蛋白质微环境的极性及氢键变化规律有着重要作用[23]。研究表明760 cm-1附近区域的拉曼峰强度降低与色氨酸残基由原本“包埋式”转变为“暴露式”有关[25]。

酪氨酸的环吸收振动和面弯曲振动产生的特征振动频率在830、850 cm-1附近。二者的相对强度（850/830）常用来鉴定酪氨酸组分埋藏和暴露的程度。当850/830比值为1.25～1.40时，酪氨酸残基趋向于“暴露”态；当850/830比值为0.3～0.5时，酪氨酸残基趋向于“包埋”态；当850/830比值为0.7时，酪氨酸残基呈电离态[26]。

表6 不同贮藏期大豆分离蛋白二硫键构型相对含量

不同贮藏期大豆分离蛋白侧链基团谱带强度变化如表7所示，在本试验中色氨酸谱带强度逐渐降低，有研究表明氧化造成的蛋白质结构破坏，会引起色氨酸残基的暴露，在拉曼谱图中表现为色氨酸谱带强度的降低[27]。随着贮藏期延长，850/830比值逐渐增加，大豆分离蛋白的酪氨酸残基趋向于“暴露态”，说明受到氧化的作用，SPI中的酪氨酸部分暴露在极性微环境中，并且作为中等强度氢键供体和受体[23]。

表7 不同贮藏期大豆分离蛋白侧链基团谱带强度

2.4 大豆分离蛋白羰基含量分析

在蛋白质氧化的过程中会伴随着发生许多反应，而羰基化作为最普遍的一种不可逆的非酶修饰的作用，是目前鉴定蛋白质氧化的典型指标之一[28]。

不同贮藏期的SPI羰基含量如图3所示，随着贮藏期的延长羰基含量增加，说明SPI在贮藏过程中发生了氧化反应。SPI在贮藏过程中可能发生反应产生活性氧或者自由基，它们会攻击蛋白质，造成主肽链的断裂或者侧链基团的氧化，从而导致羰基含量升高，蛋白质羰基化导致蛋白质结构发生变化，如断裂、交联、伸展和构象的改变[29]。

2.5 大豆分离蛋白游离巯基，总巯基及二硫键含量分析

游离巯基的含量在SPI结构中起重要作用，巯基是形成二硫键的原体，而二硫键在维持蛋白质三级结构中扮演重要角色。因此，巯基分析是探讨贮藏期间蛋白结构功能变化的一种必不可少的分析手段。表8为不同贮藏期大豆蛋白样品游离巯基、总巯基和二硫键含量。随着贮藏时间延长，游离巯基、总巯基和二硫键含量呈下降趋势。氧化可改变蛋白质中半胱氨酸的氧化还原状态以及巯基/二硫键交互反应的平衡常数，从而改变蛋白质中巯基和二硫键的数量和分布[19]。

图3 不同贮藏期大豆分离蛋白羰基含量

表8 不同贮藏期大豆蛋白样品游离巯基、总巯基和二硫键含量

SPI中的二硫键含量降低，形成了非二硫键的含硫化合物不利于凝胶形成[30]。SPI表面的巯基可以被可逆的氧化为二硫键和次磺酸状态，也可以被不可逆的氧化为亚磺酸和磺酸状态。一般情况下，游离巯基含量减小表明SPI发生了氧化变性，研究表明活性氧自由基能够和巯基快速发生反应，并转化为亚磺酰自由基，因此使之含量下降[19]。通过总巯基、游离巯基和二硫键含量的变化，分析得出氧化会在一定程度上改变SPI的结构特性。

2.6 大豆分离蛋白SDS-PAGE图谱分析

采用SDS-PAGE分析不同贮藏期大豆蛋白的组成，结果见图4。大豆分离蛋白主要由11S和7S组成，11S是一种六聚体蛋白，分子量为300～380 kDa，由5个亚基组成，每个亚基均由一条酸性肽链和一条碱性肽链通过一个二硫键连接而成。7S主要成分是、′、这3种亚基，分子质量分别约为65、62、57 kDa[31]。由图4分析可知，7S亚基含量逐渐降低，11S亚基含量较高。贮藏期0～12 d内，7S中的～、′～亚基和11S中的-亚基大幅度下降。随着贮藏天数的延长，～、′～、～亚基与B亚基的相对含量陆续下降，11S中的A肽链变化程度最小；多条肽链条带变浅，尤其是贮藏24和30 d的蛋白聚集体区域和亚基条带颜色显著变淡，说明较长时间贮藏导致大豆蛋白形成不可溶的高分子量氧化聚集体，使它们无法进入电泳胶，并且非二硫键参与了氧化聚集体的形成[32]。

注：泳道M对应标准蛋白，泳道1～6分别对应贮藏0、6、12、18、24、30 d的SPI。

2.7 千页豆腐的微结构分析

图5是由不同贮藏期时的SPI所制凝胶的电镜照片，放大倍数分别是40、200，10 000。通过观察可以看出贮藏前6 d的SPI凝胶表面比较规整，凝胶网络结构致密且分布均匀。贮藏了12和18 d后的SPI凝胶表面比较不规整，凝胶网络结构不够致密均匀。经过24和30 d贮藏后的SPI凝胶空穴气室较多，表面不规整，凝胶絮状物多，交联度较低且有不规则的网络结构[33]。

通过10 000倍镜检下对比图可以观测到，贮藏24和30 d的SPI凝胶絮状结构较多，且出现了更多由生产过程中的蛋白油脂乳化体凝胶转变而来的凝胶泡，表现为弹性降低，在一定程度上解释了较差的质构。随着贮藏期延长，SPI凝胶结构逐渐变差，研究发现蛋白质氧化聚集会破坏SPI结构的稳定性，进而降低凝胶的强度，改变其微观结构[34]。这在宏观上与本实验的研究一致。

0 d 6 d 12 d 18 d 24 d 30 d

3 结 论

依据拉曼光谱对不同贮藏期大豆分离蛋白分析，可以发现，在贮藏期0～18 d，大豆分离蛋白的-螺旋、-折叠构型含量较高，分子间二硫键向分子内二硫键转化。在贮藏期18～30 d，大豆分离蛋白无规卷曲构型含量明显增高，二硫键由分子内转化为分子间，此时大豆分离蛋白二级结构较为疏松，蛋白凝胶强度低。在整个贮藏过程中，羰基含量逐渐增加，巯基和二硫键含量逐渐下降，65、62、57、20 kDa的亚基归属条带均有所变浅，这与SPI受到氧化攻击形成的大聚集体有关，以上均验证了拉曼分析的结果。观察千页豆腐微观结构与质构特性感官评价相结合得出结论，SPI在贮藏过程中受到氧化攻击会形成氧化聚集体，影响了蛋白质的加工特性，是凝胶强度降低、口感变差的原因。综合以上结论，在试验设计的贮藏期分别为：0、6、12、18、24、30 d中分析，前18 d内的样品的品质较好，为大豆分离蛋白制成千页豆腐工业化生产提供一定理论依据。

[1] 刘頔，赵晓燕，符力丹. 大豆蛋白中7S与11S球蛋白的研究进展[J]. 食品研究与开发，2016，37(17)：201－204. Liu Di, Zhao Xiaoyan, Fu Lidan. Research progress of 7S and 11S globulin in soybean protein[J]. Food Research and Development, 2016, 37(17): 201－204). (in Chinese with English abstract)

[2] 沈鹏辉，樊诗堃，赵谋明，等. 氧化对大豆蛋白结构、乳液稳定性及消化特性的影响研究[J/OL]. 食品科学：1－12[2019-01-12]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206. TS.20180919.1356.122.html.

[3] Ana L C G, Silvana Pe, de G F. Action of microbial transglutaminase (MTGase) in the modification of food proteins: A review[J]. Food Chemistry, 2015, 171: 315－322.

[4] Orban J M, Wilson L B, Kofroth J A, et al. Crosslinking of collagen gels by transglutaminase[J]. Journal of Biomedical Materials Research. Part A, 2004, 68(4): 756－762.

[5] 李玉美，白洁，田旭，等. 千页豆腐质量影响因素及其工艺条件的研究[J]. 食品工业，2015，36(7)：65－68.

[6] Adams A, Kimpe N D, Van Boekel M A J S. Modification of casein by the lipid oxidation product malondialdehyde[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(5): 1713－1719.

[7] Martine M, Philippe G, Thierry S, et al. Chemical oxidation decreases proteolytic susceptibility of skeletal muscle myofibrillar proteins[J]. Meat Science, 2006, 73(3): 536－543.

[8] Shacter E. Quantification and significance of protein oxidation in biological samples[J]. Drug Metabolism Reviews, 2000, 32(3/4): 307－326.

[9] Wu W, Zhang C M, Hua Y F. Structural modification of soy protein by the lipid peroxidation product malondialdehyde[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2009, 89(8): 1416－1423.

[10] 周麟依，孙玉凤，吴非. 丙二醛氧化对米糠蛋白结构及功能性质的影响[J/OL]. 食品科学：1－16[2019-01-12]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.ts.20181009.1436.018. html.

[11] 江程明. 内酯豆腐和千叶豆腐生产技术研究[D]. 广州：华南理工大学，2013. Jiang Chengming. Study on Production Technology of Lactone Tofu and Chiba Tofu[D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2013. (in Chinese with English abstract)

[12] 唐文婷，蒲传奋. 千叶豆腐品质特性的影响因素研究[J]. 食品科技，2015，40(11)：30－33.

[13] 江连洲，张潇元，朱一方，等. 物理处理对大豆蛋白－磷脂酰胆碱结构影响的拉曼分析[J]. 农业机械学报，2018，49(2)：345－350.

Jiang Lianzhou, Zhang Xiaoyuan, Zhu Yifang, et al. Raman analysis of influence of physical treatment on structure and interaction of soybean protein-phosphatidylcholine[J]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2018, 49(2): 345－350. (in Chinese with English abstract)

[14] Levine R L, Garland D, Oliver C N, et al. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins[J]. Methods in Enzymology, 1990, 186(1): 464.

[15] 樊永华. 改性醇法大豆浓缩蛋白结构与功能性的相关性分析[J]. 中国油脂，2016，41(7)：29－32. Fan Yonghua. Correlation between structure and functional properties of modified alcohol leaching soybean protein concentrate[J]. China Oils and Fats, 2016, 41(7): 29－32. (in Chinese with English abstract)

[16] Shimada K, Cheftel J C. Determination of sulfhydryl groups and disulfide bonds in heat－induced gels of soy protein isolate[J] Journal of Agricultural＆Food Chemistry, 1988, 36(1): 147－153.

[17] 唐传核，杨晓泉，彭志英，等. 微生物转谷氨酰胺酶催化大豆11S球蛋白聚合研究[J]. 食品科学，2002，23(3)：42－46.

[18] Koo B C, Mi Y G, Youling L X. Effect of soy protein substitution for sodium caseinate on the transglutaminate－induced cold and thermal gelation of myofibrillar protein[J]. Food Research International, 2009, 42(8): 941－948.

[19] Thomas J A, Mallis R J. Aging and oxidation of reactive protein sulphydryls[J]. Experimental Gerontology, 2001, 36(9): 1519－1526.

[20] Barth A. Infrared spectroscopy of proteins[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2007, 1767(9): 1073－1101.

[21] Bryant R N, Pasteris J D, Fike D A. Variability in the Raman spectrum of unpolished growth and fracture surfaces of pyrite due to laser heating and crystal orientation[J]. Applied Spectroscopy, 2018, 72(1): 37－47.

[22] 齐宝坤，赵城彬，江连洲，等. 大豆分离蛋白组成及二级结构对表面疏水性的影响[J]. 中国食品学报，2018，18(5)：288－293.

[23] 吕博，李明达，张毅方，等. 用拉曼光谱分析低压均质处理对大豆分离蛋白结构的影响[J]. 现代食品科技，2018，34(10)：58－63，93.

[24] 齐宝坤，江连洲，王欢，等. 离子强度对大豆11S球蛋白表面疏水性及结构的影响[J]. 食品科学，2018，39(8)：39－44.

[25] Lichan E C Y. The applications of Raman spectroscopy in food science[J]. Trends in Food Science & Technology, 1996, 7(11): 361－370.

[26] 李丹，魏冬旭，贾烨，等. 大豆7S球蛋白结构特性与表面疏水性相关性研究[J]. 中国油脂，2017，42(4)：93－98. Li Dan, Wei Dongxu, Jia Ye, et al. Correlation between structure characteristics and surface hydrophobicity of β-conglycinin (7S)[J]. Chinese Oil and Fats, 2017, 42(4): 93－98. (in Chinese with English abstract)

[27] Xu Xianglian, Han Minyi, Fei Ying, et al. Raman spectroscopic study of heat-induced gelation of pork myofibrillar proteins and its relationship with textural characteristic[J]. Meat Science, 2010, 87(3): 159－164.

[28] 段丽菊，刘英帅，朱燕，等. DNPH比色法：一种简单的蛋白质羰基含量测定方法[J]. 毒理学杂志，2005，19(4)：320－322.

[29] Eaton P. Protein thiol oxidation in health and disease: techniques for measuring disulfides and related modifications in complex protein mixtures[J]. Free Radical Biology & Medicine, 2006, 40(11): 1889－1899.

[30] Xia Xiufang, Kong Baohua, Xiong Youling, et al. Decreased gelling and emulsifying properties of myofibrillar protein from repeatedly frozen－thawed porcine longissimus muscle are due to protein denaturation and susceptibility to aggregation[J]. Meat Science, 2010, 85(3): 481－486.

[31] 齐宝坤，赵城彬，李杨，等. 热处理对大豆11S球蛋白溶解性和二级结构的影响[J]. 食品科学，2018，39(22)：39－44.

[32] Arrese E L, Sorgentini D A, Wagner J R, et al. Electrophoretic, solubility, and functional properties of commercial soy protein isolates[J]. Agric. Food Chem, 1991, 39: 1029－1032.

[33] 汪长青，李兴江，穆冬冬，等. 预处理对大豆分离蛋白结构及凝胶性质的影响[J]. 中国粮油学报，2018，33(10)：40－46，52.

Jiang Changqing, Li Xingjiang, Mu Dongdong, et al. Effect on structure and gel properties of soybean protein isolate under pretreatments[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2018, 33(10): 40－52. (in Chinese with English abstract)

[34] 吴伟，林亲录，华欲飞. 13－氢过氧化－顺－9，反－11－十八碳二烯酸氧化修饰对大豆蛋白凝胶性质的影响[J]. 食品与发酵工业，2011，37(1)：42－746.

Effect of soy protein on the quality of Qianye tofu in different storage periods

Jiang Lianzhou1, Ran Anqi1, Jia Zixuan1, Liu Jishan2, Li Yang1, Wang Zhongjiang1※

(1.,150030,; 2.,257000,)

In this paper, the effects of different storage periods on the structure of soy protein isolate (SPI) were studied, and the effects of storage period on the quality of Qianyetofu were discussed. The content, subunit, sulfhydryl group, gel texture and sensory evaluation were determined for SPI in different storage periods, and the SPI secondary structure, disulfide bond configuration and side chain structure were analyzed by Raman spectroscopy. The measurement was carried out, and the microstructure of Qianyetofu was observed by scanning electron microscopy. The results showed that with the prolongation of storage period, the content of SPI carbonyl increased gradually; the content of disulfide bond in free sulfhydryl group and total sulfhydryl group decreased gradually; the content of secondary structure changed; the hardness of gel showed a downward trend. The sensory evaluation of Qianyetofu deteriorated in terms of taste, color and flavor; the gel network structure became looser, the degree of crosslinking decreased and the network structure was rough. This indicate that the SPI has undergone an oxidation reaction during the storage period, resulting in a change in the structure of the soybean protein, which ultimately reduces the gel properties. According to Raman spectroscopy, the analysis of soy protein isolates in different storage periods showed that the-helix and-sheet configurations were higher during the storage period of 0-18 days, and the intermolecular disulfide bonds were converted into intramolecular disulfide bonds. During the storage period of 18-30 days, the random coil configuration increased significantly, and the disulfide bond was converted from intramolecular to intramolecular. At this time, the secondary structure of soy protein was loose and the protein gel strength was low. During the whole storage process, the carbonyl content increased gradually, SPI may react during storage to produce reactive oxygen species or free radicals, which attack proteins, causing breakage of the main peptide chain or oxidation of side chain groups, resulting in elevated carbonyl content, protein carbonylation leading to changes in protein structure, the content of sulfhydryl groups and disulfide bonds decreased gradually, oxidation can change the redox state of cysteine in proteins and the equilibrium constant of thiol/disulfide bond interactions, thereby changing distribution of sulfhydryl and disulfide bonds in proteins, and the subunits of 65, 62, 57 and 20 kDa belonged to the bands, it indicates that long-term storage leads to the formation of insoluble high molecular weight oxidized aggregates of soy protein, making them unable to enter the electrophoresis gel, and non-disulfide bonds participate in the formation of oxidized aggregates, which were related to the large aggregate formed by oxidative attack of SPI. Observing the combination of the microstructure of Qianyetofu and the sensory evaluation of texture characteristics, it is concluded that the soy protein is oxidized and attacked to form oxidized aggregates, which affects the processing characteristics of the protein, which is the reason for the decrease of gel strength and poor taste. This indicates that the SPI has undergone an oxidation reaction during the storage period, resulting in a change in the structure of the soybean protein and a decrease in its gel properties.

storage; protein; agricultural products; Qianyetofu; isolated soy protein; gel quality

江连洲，冉安琪，贾子璇，刘季善，李 杨，王中江. 不同贮藏期大豆蛋白对千页豆腐品质的影响[J]. 农业工程学报，2019，35(20)：311－318. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.20.038 http://www.tcsae.org

Jiang Lianzhou, Ran Anqi, Jia Zixuan, Liu Jishan, Li Yang, Wang Zhongjiang. Effect of soy protein on the quality of Qianye tofu in different storage periods[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(20): 311－318. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.20.038 http://www.tcsae.org

2019-05-09

2019-07-09

中国博士后科学基金面上资助项目（2018M641798）；山东省泰山产业领军人才工程高效生态农业创新类项目(LJNY201607)；黑龙江省自然科学基金（C2018024）

江连洲，教授，博士生导师，主要从事粮食、油脂及植物蛋白工程研究。Email：jlzname@163.com

王中江，博士，讲师，主要从事粮食、油脂及植物蛋白工程研究。Email：wzjname@126.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2019.20.038

TS214.9

A

1002-6819(2019)-20-0311-08