闫庚戌　范丙全

摘要：通过对化肥与油菜绿肥配施的几种不同方式所引起的微生物区系变化进行研究，为探索化肥与绿肥的最佳配施方案，建立保护土壤的农田管理规程提供理论依据。土壤样品取自进行了6a化肥绿肥配合的定位试验田，共进行5个施肥方案，利用Biolog技术，对施肥后土壤的微生物数量、微生物碳、无机碳、麦角固醇进行测定分析，从而得出土壤中不同菌群数量及活性的结论。发现：低量化肥与绿肥配施有利于增加土壤有机碳、微生物碳、麦角固醇以及微生物的数量;不施肥能够提高土壤革兰氏阴性（GN）细菌和革兰氏阳性（GP）细菌的多样性，有机和无机肥料都能引起土壤GN、GP细菌多样性的下降，合理的化肥与绿肥配施，能够减缓土壤GN细菌多样性下降速度，油菜用作绿肥不利于GP细菌多样性的培育;不施肥有利于土壤SFN真菌多样性的保持，施肥会使土壤SFN真菌多样性下降，单施化肥会导致SFP真菌多样性的下降，绿肥和中量化肥配施能够提高SFP真菌的多样性。

关键词：土壤;施肥;微生物多样性

中图分类号：S-3

文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191115001

基金项目：国家自然科学基金（项目编号：30270048）;国家863项目 （项目编号：2003AA241150）;所长基金课题“农业微生物学的宏观研究”（项目编号：2002）

*为本文通讯作者

目前，我国每年的化肥施用量在6000万t左右，中国能以占世界7%的耕地养活占世界22%的人口，可以说化肥起到举足轻重的作用 [1]。然而随着化肥用量的不断增加和不合理施用，由此引发的土壤质量问题也日益凸显[2，3]。长期大量施用化肥会对土壤理化性状和生物学活性等产生恶劣影响，尤其会导致土壤微生物生物量和多样性的下降[4]。

土壤微生物可以促进土壤有机质的分解和养分转化，是作物生长氮、磷、钾、镁的重要来源[5，6]。土壤微生物受农业田间管理的影响较大，作物轮作、施肥方式和秸秆还田等都会影响土壤微生物特性 [7-10]。

近年来，随着有机肥在农业生产中的大量施用，在一定程度上减缓了化肥对土壤质量的损害。然而如果将有机肥取代化肥，又远远不能满足作物的养分需求[11]。有研究指出，将化肥与有机肥配合使用，可以协调养分供应，满足作物需求，同时减少化肥对土壤微生物活性影响[12，13]。

绿肥是最重要的有机肥之一，我国是绿肥种植最早、种植面积最大的国家 [14]。大量的科学研究表明，绿肥施用可以改善土壤理化性质，提高土壤微生物多样性 [15]。本文利用Biolog技术，对化肥与油菜绿肥配施的5种方案引起微生物多样性的影响进行研究，为探讨绿肥与化肥配施的最佳方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 土壤样品与试验设计

1.1.1 土壤样品

试验时间起始于2002年9月，地址在河北省农科院院内。首先进行6a化肥绿肥配合的定位试验。2008年5月取土样，每小区取10钻土样，混匀风干备用。土壤理化性质：全氮0.093%，有机质18.3g/kg， 速效磷21.1mg/kg，碱解氮62.8mg/kg，速效钾130mg/kg。质地为壤质褐土。

1.1.2 试验设计

[JP2]试验为随机区组设计，小区面积3m2。共设5个处理：不施肥CK;单施化肥INORG-F：N180kg/hm2[JP2]、[JP3]P2O5 120kg/hm2、K2O 105kg/hm2;高量化肥与绿肥配施GM+FH：N 180kg/hm2、P2O5 105kg/hm2、K2O 105kg/hm2 + 油菜绿肥 22500 kg/hm2;低量化肥与绿肥配施GM+FL：N 111kg/hm2、P2O581kg/hm2、K2O 70.5kg/hm2+油菜绿肥 22500kg/hm2;中量化肥与绿肥配施GM+FM：N 171kg/hm2、P2O5 141kg/hm2、K2O 70.5kg /hm2+油菜绿肥22500kg/hm2。3次重复。试验作物为小麦、玉米，播种方式一年两作。小麦播种前翻压绿肥。[JP]

1.2 样品处理及分析

土壤样品风干后过2mm 筛。其中一部分用于微生物多样性分析，另一部分用于微生物碳、麦角固醇分析。

土壤微生物数量采用平板计数法分析。从各土壤样品中称30g，置于50mL离心管中并加水調至80%田间持水量，保持23℃培育2周。然后将其称取1g稀释至浓度10-4和10-6，分别测定真菌、细菌数量及多样性;土壤全碳测定采用自动燃炉技术测定，无机碳测定用HCL溶解、气相色谱，全碳减去无机碳即为有机碳含量;微生物-C测定采用熏蒸提取法[16];麦角固醇按[17]方法分析。

1.3 BIOLOG微型培养板接种

共4种培养板，分别为Biolog-GN革兰氏阴性细菌、Biolog-GP革兰氏阳性细菌、Biolog-SFN真菌、Biolog-SFP真菌培养板。

将稀释后的10-6土壤溶液分别吸取150μL接入微型培养板Biolog-SFN和Biolog-SFP，将稀释后的10-4土壤溶液，分别吸取150μL接入微型培养板Biolog-GN和Biolog-GP，于23℃下培养，用590nm波长BIOLOG读数仪读取3d和8d光吸光值。

1.4 数据处理与分析

采用SAS统计软件对数据进行GLM分析。根据多样性指数（H）计算公式、反应孔数（S）、均匀指数（E）计算公式，计算出各值。

2 结果及分析

2.1 施肥对土壤微生物量的影响

表1显示，绿肥与低量化肥GM+FL可以增加土壤有机碳量，单施化肥会使土壤有机碳量降低;对照CK的微生物碳最低，化肥、绿肥与化肥都能够提高微生物碳量;不施肥CK与处理GM+FM麦角固醇含量最低，施肥对麦角固醇含量影响显著，绿肥与低量化肥GM+FL处理最高;所有处理中绿肥与低量化肥GM+FL的微生物量最多，CK最少。

说明，施肥并不减少微生物数量，加大磷肥用量减少微生物数量。低量化肥与绿肥有利于增加土壤有机碳、微生物碳、麦角固醇、微生物总量。

2.2 施肥对革兰氏阴性细菌影响

2.2.1对革兰氏阴性细菌多样性和均匀度指数的影响

表2显示，培养3d测定，不同施肥处理对反应孔数S未见显著影响，而对多样性指数H、均匀度指数E影响显著，不施肥CK的多样性指数最大，绿肥与低量化肥GM+FL次之，单纯化肥、绿肥与高、中量化肥配施三者較低。均匀度指数表现与多样性指数表现相同，不施肥CK、绿肥与低量化肥GM+FL均匀度E较高。单施化肥、绿肥与高中量化肥配施均匀度E较低;培养8d测定，95种碳源反应孔数S没变化，多样性指数H和均匀度指数E有所下降，处理间差异不显著。

说明，不施肥可以提高土壤革兰氏阴性细菌多样性，化肥、绿肥与化肥配施会引起革兰氏阴性细菌多样性下降，合理的化肥绿肥配施能减缓革兰氏阴性细菌多样性下降。

2.2.2 对土壤革兰氏阴性细菌利用碳源能力影响

表3显示，培养3d测定，不同的施肥处理，对碳源利用的种类和强度相差较大。绿肥与高量化肥GM+FH能够利用AD、CD、C、M等4种碳源，CK与单施化肥能较好地利用C、CD、A、AD 4种碳源，而绿肥与中量化肥GM+FM能利用AD、C、CD、M、P 5种碳源;培养8d的测定，处理未见明显差异，细菌利用6种碳源的强度增加，但是利用趋势与3d相同。而绿肥与中量化肥GM+FM对AD、C、CD、M、P等5种碳源的利用能力较强，对照CK利用6种碳源的能力都较强。

说明，不施肥能维持较高的土壤革兰氏阴性细菌多样性，绿肥与高量化肥配合可促进利用较多种类碳源的细菌种群的生长。

2.3 施肥对土壤革兰氏阳性细菌的影响

2.3.1 对革兰氏阳性细菌多样性和均匀度指数的影响

表4显示，培养3d测定，不同处理对反应孔数S、均匀度指数E未见显著影响，对多样性指数H影响显著。不施肥CK、单施化肥处理多样性指数较大，绿肥与低量化肥GM+FL、绿肥与高量化肥GM+FH处理较低，绿肥与中量化肥GM+FM的最大。均匀度指数E表现与多样性指数H相同，不施肥和单施化肥均匀度指数较大，绿肥与低量化肥、绿肥与高量化肥较低，绿肥与中量化肥的最大。培养8d测定，多样性指数H和均匀度指数E有所下降。肥料处理对反应孔数S的影响具有显著差异，CK最大，绿肥与低量化肥GM+FL的S值最小。

说明，不施肥能保持土壤革兰氏阳性细菌多样性，绿肥与化肥配施、单施化肥都将导致革兰氏阳性细菌多样性下降。油菜绿肥不利于革兰氏阳性细菌多样性培养。

2.3.2 对土壤革兰氏阳性细菌利用碳源能力影响

表5所示，培养3d测定，各处理对P类碳源利用的差异显著，而对C、CD、A、AD、M碳源利用的影响不明显，但利用碳源的种类和强度明显不同。单施化肥NORG-F能利用碳源C、CD、A、AD、M，CK、绿肥与低量GM+FL能较好利用碳源AD、CD、C、M，绿肥与中量化肥GM+FM处理能够利用碳源CD、C、M、P，绿肥与高量化肥GM+FH能够利用6种碳源;培养8d测定，各处理对6种碳源的利用强度增加，尤其对A类碳源利用强度有显著增强。单施化肥对A类碳源的利用显著大于其他处理。CK能较好利用6类碳源，绿肥与低量化肥GM+FL利用AD、M碳源较好，绿肥与中量化肥GM+FM利用A、C、M等3类碳源较好，绿肥与高量化肥GM+FH利用A、C、CD碳源较好。

说明，化肥、绿肥与化肥配施会导致土壤中利用某几种碳源的革兰氏阳性细菌群生长，然而多样性会下降。这一点与多样性分析是一致的，施肥多样性低，不施肥多样性高。

2.4 施肥对土壤SFN真菌的影响

2.4.1 对土壤SFN真菌多样性指数等的影响。

表6显示，培养3d测定，单施化肥、绿肥与高量化肥GM+FH较低，绿肥与低量化肥GM+FL的S值最大，但与不施肥CK、绿肥与中量化肥GM+FM差异不明显。单施化肥多样性指数最小，绿肥与低量化肥GM+FL的多样性指数H最大，不施肥CK、绿肥与高量化肥GM+FH较大。均匀度指数E也表现出与多样性指数H相同的趋势，绿肥与低量化肥处理均匀度较高，但与不施肥CK、绿肥与中量化肥GM+FM的均匀度差异不明显;培养8d测定，95种碳源反应孔数S变化不明显，多样性指数H和均匀度指数E与3d相比略有提高。各处理间多样性指数H 变化显著，不施肥CK多样性最高，单施化肥最低，CK、绿肥与低量化肥GM+FL、绿肥与中量化肥GM+FM三者间差异不显著。

说明，不施肥有利于土壤SFN真菌多样性保持，化肥、化肥与绿肥配施会导致土壤SFN真菌多样性下降，绿肥与低、中量化肥配施，能维持较高的土壤SFN真菌多样性。

2.4.2 对土壤SFN真菌利用碳源能力的影响

表7显示，培养3d测定，土壤SFN真菌对不同碳源利用受处理影响不显著。从趋势看，绿肥与低量化肥GM+FL对6类碳源利用能力最高;培养8d的测定，土壤SFN真菌对6种碳源的利用强度明显高于3d，各处理对A类碳源的利用强度影响显著，对其他5类影响不明显。绿肥配施中量化肥GM+FM利用A的强度最高（这可能与磷肥用量高有一定的关系），不施肥CK次之，单施化肥处理较低。绿肥与中量化肥GM+FM和CK利用6类碳源的能力都强。绿肥与高量化肥GM+FH对6类碳源的利用能力最低。

说明，绿肥与高量化肥配施不利于土壤SFN真菌多样性培育，不施肥有利于SFN真菌多样性培育。增加磷肥用量可能有利于SFN真菌多样性培育，氮肥可能不利于SFN真菌多样性培育。

2.5 施肥对土壤 SFP真菌的影响

2.5.1 对土壤SFP真菌多样性指数等的影响

表8显示，培养3d测定，各处理对反应孔数S、多样性指数H影响不明显。绿肥与高量化肥GM+FH的S值最大，CK最低;绿肥与高量化肥配合GM+FH的多样性指数H值最高，单施化肥最低。各处理对均匀度指数E影响显著，绿肥与低量化肥GM+FL的E值最大，但与其他处理没有明显差异;培养8d测定，反应孔数S没发生变化，多样性指数H和均匀度指数E比3d有很大提高。各处理对反应孔数S、均匀度指数E影响不显著，但对多样性指数H影响显著。绿肥与中量化肥GM+FM的多样性指數最大，单施化肥最低， CK较高，不施肥、绿肥与低量化肥、绿肥与高量化肥3者差异不显著。

说明，绿肥与中量化肥配施能提高土壤SFP真菌多样性，单施化肥SFP真菌多样性会下降，不施肥维持较高的SFP真菌多样性。增施磷肥能增加土壤SFP真菌的多样性。

2.5.2 对土壤SFP真菌碳源利用能力的影响

表9显示，培养3d测定，各处理对土壤SFP型真菌利用6种碳源的能力影响不显著。从代谢强度看，各施肥处理利用碳源能力，都比不施肥CK大。不同处理利用碳源种类也存在差异，绿肥与中量化肥GM+FM利用种类多、强度大，CK、绿肥与高量化肥GM+FH处理能较好利用AD、CD、C、M碳源，绿肥与低量化肥GM+FL对6类碳源利用较高。培养8d测定，土壤SFP真菌对6种碳源利用强度明显要高于3d，各处理对M类碳源的利用强度影响明显，而对其它5类碳源影响不明显。绿肥与低量化肥GM+FL利用6种碳源的能力最高，其中M达到显著差异。

说明，绿肥与化肥配施能促进多种碳源的土壤SFP真菌生长，单施化肥引起利用各种碳源真菌群的下降，CK利用碳源种类较少，不利于SFP真菌的生长。

3 讨论

[HTH][STHZ]3.1 单施化肥[HT] 与不施肥相比，土壤微生物总量的提高不明显，却明显限制了土壤中细菌和真菌多样性。刘武星等[18-20]研究发现，不施肥能够提高土壤中革兰氏阳性、阴性细菌多样性，施用化学肥料能导致土壤细菌多样性的下降，合理的化肥与绿肥配合施用能够减缓土壤细菌多样性的下降;这些观点与本研究基本相符。

绿肥与化肥配施，可以明显提高土壤微生物总量。田伟等[21]研究表明，绿肥施用能够显著提高土壤微生物数量。万水霞等[22]研究证明长期施用紫云英可以提高土壤微生物总量58.09%～86.86%。佀国涵等[23]研究也认为，绿肥和化肥配施，明显提高了土壤细菌、AM真菌及微生物总量。

[HTH][STHZ]3.2 低量化肥[HT] 与绿肥配施会导致细菌多样性降低，但可以维持较高真菌的多样性;高量化肥与绿肥配施有利于革兰氏阴性细菌的多样性，但不利于SFN真菌多样性。孟庆杰等[24]研究表明施肥会影响土壤细菌多样性，不施肥细菌多样性高，化肥有机肥配施次之，单施化肥最低。Elfstrand S等[25]研究揭示，施用有机肥可以明显促进真菌的生长。

[HTH][STHZ]3.3 氮肥不利[HT] 于真菌多样性培育，适当增施磷肥有利于土壤真菌多样性提高，但会导致微生物总量降低。这一点目前有分歧，如张成霞等[26]认为长期施用磷肥会增加土壤微生物量;而张彦东[27，28]等研究认为施用磷肥后，土壤微生物量增加并不明显，磷不是影响土壤微生物的主要因素。有些研究则将化肥对土壤微生物影响倾向于均衡营养的论点，指出如果有些养分因长期得不到满足就会成为限制因子，如长期氮处理或氮钾处理，磷就会成为限制因子，长期磷钾肥处理，氮可能就成为限制因子，限制因子养分丰缺程度不同，就会影响土壤微生物的数量[29]。

4 结论

低量化肥与绿肥配施有利于增加土壤有机碳、微生物碳、麦角固醇以及微生物数量。

不施肥能够提高土壤革兰氏阴性和阳性细菌的多样性，使用化肥、绿肥与化肥配施都引起土壤革兰氏阴性和阳性细菌多样性的下降，只有合理的化肥与绿肥配施，才能够减缓土壤革兰氏阴性细菌多样性下降的速度。绿肥与高量化肥配施能够刺激和促进利用较多种类碳源的细菌种群的生长与发育。油菜作为绿肥不利于革兰氏阳性细菌多样性的保持与培养。

不施肥、绿肥与低、中量化肥有利于土壤SFN真菌多样性的保持，化肥、高量化肥与绿肥配施会导致土壤SFN真菌多样性下降。增加磷肥用量导致微生物总量下降，但有利于SFN真菌真菌多样性提高，氮肥对SFN真菌真菌多样性产生不良效果。

不施肥处理会使土壤SFP真菌利用碳源种类较少，不利于生长。绿肥与中量化肥能够提高SFP真菌的多样性，磷肥可能是SFP真菌多样性增加的重要因素。单施化肥会引起利用各种碳源SFP真菌多样性下降，适量绿肥与化肥配施能增加利用多种碳源的真菌生长。

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作者简介：

闫庚戌（1970-），男，本科，高级农艺师。研究方向：蔬菜技术推广与农产品质量安全检验检测;

范丙全（1956-），男，博士生导师，研究员。研究方向：土壤微生物与农业微生物资源利用。