何平 刘家丰 宁瑞卓 邹晓微 申龙健 范文慧

[摘要]目的 分析血浆长链非编码RNA INK4位点反义非编码RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，AN-RIL）联合脂蛋白相关磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2）及血浆淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA）在缺血性脑卒中（ischemic stroke，LS）的诊断、预后价值。方法分别收集我院IS患者和健康人群各140例作为观察组和对照组。血浆ANRIL采用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测;Lp-PLA2与SAA分别采用酶联免疫吸附法和化学发光法检测。结果观察组血浆ANRIL、Lp-PLA2与SAA水平均显著高于对照组（P<0.05）。LS患者血浆4NRIL，Lp-PLA2与SAA水平与NIHSS评分显著相关（r=0.57，P<0.05;r=0.55，P<0.05;r=0.54，P<0.05）。ANRIL联合Lp-PLA2与SAA在区分IS与健康对照者的曲线下面积为0.95（95% CI：0.91～0.99，P<0.05），灵敏度82.71%，特异度98.42%。在校正年龄、性别、吸烟史、饮酒史、高血压、糖尿病、高胆固醇血症等影响因素后，高ANRIL、Lp-PLA2与SAA水平是IS发病的独立危险因素。Kaplan Meier生存分析发现，相比低ANRIL组，高ANRIL组生存时间显著降低（χ²=17.66，P<0.05）;相比低Lp-PLA2组，高Lp-PLA2组生存时间显著降低（χ²=8.94，P<0.05）;相比低SAA组，高SAA组生存时间显著降低（χ²=4.53，P<0.05）。结论 血浆ANRIL、Lp-PLA2与SAA是IS诊断及预后评估的潜在标志物。

[关键词]缺血性脑卒中;长链非编码RNA;脂蛋白相关磷脂酶A2;血漿淀粉样蛋白A

中图分类号：R743 文献标识码：A 文章编号：1009-816X（2019）05-0397-04

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.05.003

脑卒中是一种因突发性脑血管发生阻塞或破损导致大脑供血不足/失去供血而使脑组织缺氧受损的疾病，其中，又以缺血性脑卒中（ischermc stroke，IS）最为常见[1]。炎症反应可促进血管内皮细胞损害，进而加快粥样斑块在损伤的内皮细胞表面沉积，加速IS的形成[2]。因此，炎症指标升高被认为是IS形成的一个重要诱因[3]。研究指出，长链非编码RNA（longnon-coding RNA，lnCRNA）INK4位点反义非编码RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL）水平在经缺氧或高血糖诱导的内皮细胞中显著上调，被认为是参与调节血管内皮细胞功能的重要分子[4]。脂蛋白相关磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholi-pase A2，Lp-PLA2）是一类重要的血管炎症标志物，其水平增高被认为是诱发心血管疾病的高危因素[5]。血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA）属于急性相反应蛋白，对于评估体内炎症程度有一定价值[6]。本研究通过比较IS患者与健康体检者血浆ANRIL、Lp-PLA2与SAA水平，旨在探究三者在IS诊断及预后评估中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集本院2017年1月到2018年1月期间经CT或MRI确诊IS的患者140例为观察组，其中男93例，女47例，年龄48～66岁，平均（58.31±5.81）岁，并计算国立卫生院卒中量表（national insti-tutes of health stroke scale，NIHSS）评分[7]。同期纳入我院健康体检者140例为对照组，其中男95例，女45例，年龄49～67岁，平均（60.11±6.32）岁。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。样本例数计算的统计学依据为：n=2&μ_α+μ_β）2γ²/δ²，其中μ_α为一类错误概率μ的值，本次研究规定α=0.05，查表得μ_α为1.96;μ_β为二类错误概率μ的值，本次研究规定β=0.20，查表得μ_β为0.84;γ²为总体方差，查表得γ（0.05，0.20）²为12.65;δ为观察组与对照组的患病率之差，因人群中IS发病率约为15%，故δ值约为0.85。最终计算得到的病例标本量至少应为127例。本研究的开展经医院伦理委员会批准。

1.2 方法：收集研究对象吸烟史、饮酒史、高血压（收缩压/舒张压大于140/90mmHg或高血压病史或正在服用降压药者）、糖尿病（空腹血糖大于126mg/dL或糖尿病史或正在服用降血糖药物）、高胆固醇血症（正在服用降脂药物）等资料。此外，对纳入的140例IS患者进行3个月的随访。采用乙二胺四乙酸抗凝紫管采集观察组入院2h后及对照组外周静脉血2mL，并于1h内分离血浆。血浆SAA的检测采用化学发光法，试剂由上海百蕊生物科技有限公司提供。采用酶联免疫吸附法检测两组血浆Lp-PLA2水平，检测试剂盒购自北京金山川科技发展有限公司。按照血浆RNA提取试剂盒说明书步骤进行总RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因组逆转录试剂盒逆转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测。反应采用20[L体系，即：SYBR GREEN Mix 8μL，上下游引物各0.80μL，cDNA4μL，去除RNA酶水6.40μL。循环条件：95℃变性5min;95℃30s，58℃30s，72℃ 30s，38个循环。使用的ANRIL与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物序列见表1。采用2^-△Ct法计算ANRIL的相对表达量，△Ct值=样本Ct值-GAPDH Ct值。

1.3 统计学处理：应用SPSS 19.0版软件分析。正态分布计量数据用（x±s）表示，两组间比较采用t检验。计数资料用率表示，组间比较采用卡方检验。相关性分析采用斯皮尔曼检验。采用受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）计算ANRIL、Lp-PLA2与SAA对IS的鉴别价值。采用二元Logistic回归计算三者预测is风险的比值比（odds ra-tio，OR）。采用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料及血浆ANRIL、Lp-PLA2与SAA水平比较：与对照组相比，观察组血浆ANRIL、Lp-PLA2与SAA水平显著升高（P<0.05），见表2。

2.2 血浆ANRIL、Lp-PLA2与SAA水平与IS临床特征间的相关性：血浆ANRIL、Lp-PLA2及SAA水平与IS患者NIHSS呈线性关联，见表3。

2.3 ROC曲线分析：血浆ANRIL、Lp-PLA2与SAA区分IS患者与健康对照者的曲线下面积分别为0.91（95%CI：0.88～0.99，P<0.05）、0.88（95%CI：0.83～0.95，P<0.05）和0.67（95%CI：0.59～0.78，P<0.05）;灵敏度及特异度分别为81.21%/83.72%、77.10%/81.42%和70.11%/57.93%;截断值分别为17.32（-log）、220.83μg/L和28.22mg/L（图1A）。联合血浆ANRIL、Lp-PLA2与SAA时，3种指标在区分IS患者与健康对照者的曲线下面积为0.95（95% CI：0.91～0.99，P<0.05，图1B），灵敏度82.71%，特异度98.42%。

2.4 ANRIL、Lp-PLA2与SAA水平对IS发生风险的预测价值：单因素分析结果显示，高ANRIL、Lp-PLA2与SAA水平是IS发病的危险因素。多因素分析显示，在校正年龄、性别、吸烟史、饮酒史、高血压、糖尿病、高胆固醇血症等因素影响后，高ANRIL、Lp-PLA2与SAA水平是IS发病的独立危险因素。见表4。

2.5 血浆ANRIL、Lp-PLA2与SAA水平对LS患者的生存分析：140例IS患者中死亡28例。依据ANRIL、Lp-PLA2与SAA中位数分别分为各高、低水平组。高ANRIL组患者的生存时间较低ANRIL组显著降低（χ²=17.66，P<0.05，图2A）;高环-PLA2组患者的生存时间较低Lp-PLA2组显著降低（χ²=8.94，P<0.05，图2B）;高SAA组患者的生存时间较低SAA组显著降低（χ²=4.53，P<0.05，图2C）。

3 讨论

随着1ncRNAs参与IS机制研究逐渐深入，1ncR-NA通过炎症反应通路在IS进程中的作用有了越来越深入的了解。本研究探讨了ANRIL在IS中的临床价值，发现IS患者血浆ANRIL水平明显高于健康对照，且与NIHSS评分相关。近年来，越来越多的证据表明ANRIL和心血管疾病如心肌梗死、糖尿病视网膜病变等关系密切[8，9]。近期有研究发现，ANRIL参与内皮细胞炎症的发生，而在敲除ANRIL后可以显著降低多种促炎症因子的表达[8]。Schulz等[9]发现ANRIL表达水平的增高可以促进微血管渗漏和炎症反应等的发生，而降低ANRIL的表达可提高视觉功能并能降低糖尿病诱导的促炎症蛋白的表达。这些研究表明，IS患者血浆中ANRIL水平的增高可能参与了机体的炎症反应。本文通过临床样本检测出IS患者高水平血浆ANRIL的表达，与前期的基础研究结果相一致[8，9]。

Lp-PLA2主要是由巨噬细胞合成释放，是反映血管炎症的重要标志物之一，国内外研究也指出高水平Lp-PLA2是心血管疾病的危险因素[10，11]。本研究结果表明，与健康对照组相比，IS患者血浆Lp-PLA2水平显著上升，分析主要是由于IS患者脑脊液中Lp-PLA2由血脑屏障进入外周血造成。SAA是评估机体急性相反应程度的重要生物学指标，其在提示機体氧化应激状态下所引起的炎症反应方面具有较高的灵敏度[12，13]。血管内皮细胞炎症与氧化应激是IS发生的重要病理基础。本文通过临床样本检测出IS患者高水平血浆SAA的表达，与前期的基础研究结果相呼应[12，13]。

ROC曲线分析显示，血浆ANRIL、Lp-PLA2与SAA区分IS患者与健康对照者时具有一定的价值，当联合ANRIL、Lp-PLA2与SAA指标时在区分IS患者与健康对照者的特异度达到98.42%，提示联合上述三种标志物具有较高的临床应用价值。在校正年龄、性别、吸烟史、饮酒史、高血压、糖尿病、高胆固醇血症等多个传统IS风险因素影响后，本文发现血浆高ANRIL、高Lp-PLA2与高SAA水平是IS发病的独立危险因素。进一步的生存分析也提示，高ANRIL、高Lp-PLA2与高SAA水平患者的预后较低水平者更差。上述研究提示，血浆ANRIL、Lp-PLA2与SAA在IS诊断及预后中具有重要临床价值。

综上所述，本文发现血浆ANRIL、Lp-PLA2与SAA的差异表达在用于IS患者诊断及预后评估时具有较高价值。

参考文献

[1]Kim BJ，Lee SH，Ryu WS，et al.Adipocytokines and ischemic stroke，differential associations between stroke subtypess[J].J Neurol Sci，2012，312（1-2）：1 17-122.

[2]Li R，Liu W，Yin J，et al.TSC-6 attenuates inflammation-induced braininjury via modulation of microglial polarization in SAE rats through theSOCS3/S'I'A13 pathway[J].J Neuroinflammation，2018，15（1）：231.

[3]Malone K，Amu S，Moore AC，et al.The immune system and stroke：fromcurrent targets to future therapy[J].lmmunol Cell Biol，2019，97（1）：5-16.

[4]Bao MH，Szeto V，Yang BB，et al.Long non-coding R1NAs in ischemicstroke[J].Cell Death Dis，2018，9（3）：281.

[5]Tibuakuu M，Kianoush S，DeFilippis AP，et al.Usefulness of lipoprotein-associated phospholipase A2 activity and C-reactive protein in identifyinghiglrrisk smokers for atherosclerotic cardiovascular disease（from theAtherosclerosis Risk in Communities Study）[J].Am J Cardiol，2018，121（9）：1056-1064.

[6]朱颖炜，韦凡平，程震锋.丹参川芎嗪注射液对AFCOPD并发肺心病患者血清SAA、BNP的影响[J].心脑血管病防治，2017，17（3）：215-216.

[7]Kwah LK，Diong J.National Institutes of Health Stroke Scale（NIHSS）[J].J Physiother，2014，60（1）：61.

[8]Xiong L，Liu W，Gao L，et al.The anril genetic variants and their inter-actions with environmental risk factors on atherothrombotic stroke in a hanChinese population[J].J Stroke Cerebrovase Dis，2018，27（9）：2336-2347.

[9]SchulZ S，Seitter L，Werdan K，et al.Single nucleotide polymorphisrs inlong noncoding RNA，ANRIL，are not associated with severe periodontitisbut with adverse cardiovascular events among patients with cardiovasculardisease[J].J Periodontal Res，2018，53（5）：714-720.

[10]Alkumishy HM，Al-Gareeb Al，Waheed HJ.Lipoprotein-associated phos-pholipase A2 is linked with poor cardio-metabolic profile in patients with is-chexnic stroke：A Study of Effects of Statins[J].J Neurosci Rural Pract，2018，9（4）：496-503.

[11]王賢进，赵艳芳.最大颈动脉内膜中层厚度与脂蛋白相关磷脂酶A2对冠心病的预测作用[J].现代医学，2016，44（11），1487-1492.

[12]Uhde M，Ajamian M，Li X，et al.expression of C-reactive protein andserum amyloid A in early to late manifestations of lyme disease[J].ClinInfect Dis，2016，63（11）：1399-1404.

[13]Watanabe K，Uchida K，Chambers JK，et aI.Deposition，clearance，andreinduction of amyloid A amyloid in interleukin 1 receptor antagonist knock-out mice[J].Vet Pathol，2017，54（1）：99-110.

（收稿日期：2019-5-19）

作者单位：150010 黑龙江哈尔滨市第一医院神经内科

作者简介：何平（1986-），硕士，医师