杨式华， 刘祥义， 徐济仓， 杨 蕾， 邓国宾， 侯 英*， 杨庆娇

(1.云南佩林科技有限公司，云南 昆明 650201； 2.西南林业大学， 云南 昆明 650224； 3.云南中烟技术中心， 云南 昆明 650231； 4.云南空港物流有限公司， 云南 昆明 650100)

天麻(GastrodiaelataBl.)是我国传统名贵中药材，为兰科天麻属多年生草本植物，药用部位为天麻的干燥块茎，对于失眠、高血压、偏头痛、神经病变及心脑血管疾病等有较好的治疗效果[1-3]，常用于治病、滋补及保健有机结合的药膳，极具营养价值。天麻中含有多种活性成分，有机酸即是其中一类[4]。研究表明，中药有机酸类成分多为非挥发性有机酸(Nonvolatile Organic Acids , NVOAs)，具有抗氧化、保肝、免疫调节、抑菌、抗病毒等药理作用[5]。特别是天麻NVOAs中的柠檬酸，其与巴利森苷(Parishins)及其衍生物有关。巴利森苷是天麻的主要有效成分，是天麻素与一分子柠檬酸缩合而成的酯类结构[6]，因而，准确测定天麻中有机酸含量，对评价天麻的药用价值与食用价值，特别是测定天麻中柠檬酸含量对研究巴利森苷及其衍生物在不同条件下的降解规律具有重要意义。目前，天麻品质的评价主要集中于天麻素的含量和活性研究[7-8]，天麻中有机酸的研究多为定性分析[9]，仅见柠檬酸的定量分析[4]，未见天麻中多种非挥发性有机酸的快速定量测定方法。因此，采用样品衍生化、GC-MS技术，建立快速定量测定天麻中6种非挥发性有机酸(草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸)含量的方法，以期为天麻品质的鉴定、药用价值及食用价值的评价提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 10份天麻样品为2017年采集，其中1～8号样采自云南昭通，9号样采自湖北宜昌，10号样采自陕西汉中，并经西南林业大学刘祥义教授鉴定。样品采集后用自来水洗净块茎部位，再用蒸馏水冲洗3次，隔水蒸透心，60℃烘箱干燥。粉碎后过60目筛，编号存放于自封袋中备用。

1.1.2 仪器及设备 Agilent 6890-5973N气质联用仪(美国Agilent公司)，JP-040S型超声波萃取仪(深圳市洁盟清洗设备有限公司)，MS204E型电子天平(感量0.000 1 g，瑞士METTLER TOLEDO 公司)，Ф13 mm×0.2 μm微滤膜过滤器(天津腾达过滤器件厂)，Milli-Q 纯水仪(美国Millipore公司)。

1.1.3 试剂 甲醇、正己烷(德国Merck公司)，浓硫酸、对甲基苯磺酸(PTSA)均为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司)。对照品：草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸均为分析纯，纯度均大于98%(Fluka公司)。内标：己二酸(纯度大于98.5%，Fluka公司)；内标溶液：用己二酸配制相应的内标甲醇溶液。衍生化试剂(H2SO4/ PTSA /CH3OH)：配制含10%浓硫酸和5%对甲苯磺酸的甲醇溶液。

1.2 方法

1.2.1 非挥发性有机酸的提取及测定条件的优化

1) PTSA浓度。选择10%硫酸+PTSA的甲醇溶液体系作为有机酸的衍生化(酯化)试剂。称样品1.00 g，加内标溶液1.0 mL、衍生化试剂8.0 mL，分别用PTSA浓度为1%、2%、5%、10%、15%的甲醇(含10%硫酸)酯化试剂对同一样品在50℃下酯化45 min，考察不同PTSA浓度下的非挥发性有机酸含量。

2) 酯化温度。称样品1.00 g，加内标1.0 mL、衍生化试剂8.0 mL，酯化时间45 min，考察酯化温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的非挥发性有机酸含量。

3) 酯化时间。称样品1.00 g，加内标1.0 mL、衍生化试剂8.0 mL，酯化温度50℃，分别考察酯化时间为15 min、30 min、45 min、60 min、75 min的非挥性有机酸含量。

4) 萃取方式和时间。采用超声萃取和振荡萃取样品中的有机酸酯，比较不同萃取方式对样品中非挥发性有机酸的提取效果。在最佳提取方式下，考察萃取时间分别为5 min、10 min、15 min、20 min和25 min的非挥发性有机酸含量。

1.2.2 GC-MS仪器分析条件 载气，He；载气流速1.2 mL/min；色谱柱：HP-5MS(30 m× 0.25 mm× 0.25 μm)，进样量1.0 μL，分流比20∶1，恒流模式；接口温度275℃，离子源温度230℃ ，电离能70 eV，质量扫描范围：30～400 amu，进样口温度270℃。程序升温：60℃下保持1 min，以6℃/min的速率升至270℃，保持8 min。

1.2.3 标准曲线的建立 分别称取草酸、棕榈酸、亚油酸、油酸100 mg，苹果酸、柠檬酸1 000 mg于50 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，母液浓度：草酸、棕榈酸、亚油酸、油酸浓度为2 mg/mL，苹果酸、柠檬酸浓度为20 mg/mL。

依次移取上述母液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即为系列浓度标准工作溶液。分别取上述标准工作溶液1 mL，加1.0 mL内标溶液、8.0 mL衍生化试剂，于优化的条件下酯化，冷至室温，加20 mL正己烷，称重；在优化的提取条件下提取NVOAs，用GC-MS仪器测定，以浓度为横坐标，响应值为纵坐标，建立标准曲线。

1.2.4 重现性及回收率的测定 昭通天麻是目前国内品质最好的天麻之一，选择2号昭通天麻样品考察方法的重现性和回收率。分别称取2号样品6份，采用优化的前处理条件对样品进行处理后，用GC-MS仪器测定，计算方法的重现性。另称取7份同一样品，其中6份加入不同浓度的标准品溶液1.0 mL(苹果酸和柠檬酸浓度低、中、高依次为1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL，其余有机酸浓度依次为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL)，采用优化的前处理条件对样品进行处理后，用GC-MS仪器测定，计算方法的回收率。

1.2.5 样品的测定 称取1.00 g样品于具塞锥形瓶中，加1.0 mL内标溶液、8.0 mL衍生化试剂，于优化的酯化温度下酯化，冷至室温，加20 mL正己烷，称重；在优化的提取条件下提取非挥发性有机酸，静置分层后，加正己烷补足重量；吸取上层正己烷清液2 mL，用滤膜过滤器过滤，弃去前0.5 mL后，滤入进样瓶中，进GC-MS仪器进行分离和鉴定；采用质谱定性、内标法定量测定及校正曲线的制作。

2 结果与分析

2.1 不同因素对非挥发性有机酸酯化及提取效果的影响

2.1.1 PTSA浓度 从图1可知，有机酸测定值随PTSA浓度增加而升高，当PTSA浓度达5%，草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸及油酸均酯化反应完全，增加PTSA浓度非挥发性有机酸含量没有明显变化，故选择浓度为硫酸10%和PTSA5%的甲醇溶液作为酯化试剂。

图1 不同酯化及萃取条件下的非挥发性有机酸含量

2.1.2 酯化温度 温度是影响有机酸酯化的关键因素，温度过低酯化反应较慢且不完全。随着酯化温度的升高，非挥发性有机酸含量明显增加，当酯化温度为50℃时，草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸及油酸均酯化完全，继续升高温度，非挥发性有机酸含量未见增加，故选择酯化温度为50℃(图1)。

2.1.3 酯化时间 反应时间对酯化完成度有明显影响，随着酯化时间增加，非挥发性有机酸含量明显增加，在45 min时有机酸即完全酯化(图1)，增加酯化时间，草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸及油酸含量未见明显增加，酯化60 min非挥发性有机酸含量反而略有下降，故选择酯化时间为45 min。

2.1.4 萃取方式和萃取时间 从图1可看出振荡萃取的草酸、苹果酸、柠檬酸、亚油酸等含量低于超声萃取；且超声萃取10 min，草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸及油酸含量达到萃取平衡，故最佳提取方式为超声萃取10 min。

2.2 标准曲线

从表1看出，草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸6种非挥发性有机酸标准曲线的相关系数均大于0.999 0，检出限为0.04～2.00 mg/g，方法具有良好的线性关系。

表1 非挥发性有机酸的回归方程、相关系数和检出限

注：AR为相对峰面积；CR为相对浓度。

Note: ARand CRrefer to relative peak areas and relative concentration respectively.

2.3 重现性和回收率

从表2可知，非挥发性有机酸 6次测定的RSD在1.04%～3.59%，能够满足样品分析精密度要求。6种非挥发性有机酸酸的加标回收率为89.2%～102.1%，表明该方法测定天麻非挥发性有机酸具有较好的回收率，可用于天麻样品非挥发性有机酸的定量分析。

2.4 天麻样品中6种非挥发性有机酸的含量

从表3可知，天麻中含有丰富的非挥发性有机酸，其中苹果酸的含量最高，平均值为5.00 mg/g，其次是柠檬酸含量，平均值为3.47 mg/g，油酸的含量最低，平均值为0.13 mg/g。云南昭通天麻与湖北宜昌、陕西汉中的相比，柠檬酸含量较高，表明昭通天麻中有效成分较其他地区好。

表3 天麻样品中非挥发性有机酸的含量

3 结论与讨论

建立了衍生化GC-MS法快速定量测定天麻中非挥发性有机酸含量的方法，优化的前处理条件为10%硫酸+5% PTSA的甲醇溶液，酯化温度为50℃，酯化时间为45min，酯化完后采用超声萃取10 min。方法评价结果显示，6种非挥发性有机酸标准曲线的R2均大于0.999 0，检出限为0.04～2.00 mg/g，6次测定的RSD在1.04%～3.59%，回收率为89.2%～102.1%。天麻中苹果酸的含量最高，平均为5.00 mg/g；其次是柠檬酸含量，平均为3.47 mg/g；油酸含量最低，平均为0.13 mg/g。云南昭通天麻与湖北宜昌、陕西汉中的相比，柠檬酸含量较高[6]，表明昭通天麻中有效成分较其他地区的好。

所建立的方法简便、快速、重现性好，可应用于天麻中非挥发性有机酸含量测定。由于其他省份天麻样品数量较少，后续研究可增加云南省外的天麻样品的测定数据，再进行对比分析，进而得出更为客观的对比分析结果。