洪星辉，王 靓，方海雁，黄金玲

(1.安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学护理学院，安徽 合肥 230012)

胃癌是一种侵袭性较强的消化道恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居于恶性肿瘤的前列[1]。据报道，中国每年新增病例大约占全球的40%[2]。尽管近年来对早期胃癌的诊断技术不断进步，外科微创技术和化学治疗等多种治疗手段也已广泛运用于胃癌的治疗,但是进展期胃癌的预后差和5年存活率低的问题仍然没有得到有效的解决。因此，如何有效抑制进展期胃癌的浸润和转移不仅是目前科研探索的方向，更是提高临床疗效和改善患者术后生存率的关键性问题。

重楼总皂苷(Rhizoma Paridis total saponin，RPTS)是从中药重楼中提取出来的一种皂苷类成分。《神农本草经》中记载重楼具有清热解毒、消肿止痛的功效。现代药理学研究表明RPTS具有较好的抗肿瘤活性，对胃癌、结直肠癌、肺癌等多种肿瘤细胞增殖均有明显的抑制作用[3-6]。但是RPTS抗肿瘤侵袭转移方面的作用及其机制还少有文献报道。本实验旨在观察RPTS对人胃癌细胞SGC-7901增殖、迁移和侵袭能力的影响。

1 材料与仪器

1.1 细胞 人胃癌细胞SGC-7901购自中科院上海细胞研究所细胞库。

1.2 药物与试剂 重楼为中药饮片，采购自安徽济仁药业有限公司，产地为云南，批号111012，经安徽中医药大学中药与资源教研室俞年军教授鉴定，确认为云南重楼ParispolyphyllaSmithvar.yannanensis(Franch)Hand.-Mazz。按照参考文献[7-10]方法提取制备得干浸膏。高氯酸比色法[11]测定重楼醇提物中PRTS质量分数为62.6%。四甲基偶氮唑蓝( methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自美国Sigma公司；DMEM高糖细胞培养基、胎牛血清购自美国HyClone公司；Transwell小室(直径8 μm)购自美国Millipore公司。

1.3 主要仪器 Forma 370细胞培养箱：美国Thermo公司；Centrifuge 5430R超低速离心机：德国Eppendorf公司；SPEC-TRAMax M2e酶标仪：美国Molecular Devices公司；BX51倒置显微镜：日本Olympus公司。

2 方法

2.1 细胞培养 SGC-7901细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中,37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养,取对数生长期细胞进行各项实验。

2.2 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期的SGC-7901细胞，胰酶常规消化，用DMEM高糖完全培养液调整细胞浓度至5.0×104/mL，将细胞悬液以每孔200 μL接种于96孔培养板中，在37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养24 h后，于各孔中加入终浓度分别为0、2.5、5、10、20、40 μg/mL RPTS，每组6个复孔，继续培养24 h，到达时间作用点后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL、37 ℃孵育4 h，弃上清后加入150 μL DMSO,平板摇床震摇10 min，用酶标仪测量各孔在490 nm波长处的吸光度(absorbance, A)，用光密度(optical density, OD)值表示A的大小。实验重复3次，计算细胞活力(cell viability ratio,RCV)。RCV的计算公式：

RCV=(A实验―A空白)/(A对照―A空白) 100%。

2.3 细胞划痕实验检测细胞迁移率 取对数生长期的SGC-7901，计数，调整细胞浓度至7×105/mL，接种于6孔板当中。置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中，待细胞贴壁，用10 μL枪头在孔板底部中央均匀划出一条横线，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline， PBS)清洗后，在各孔中分别加入终浓度为0、2.5、5、10 μg/mL的RPTS，用无血清高糖DMEM培养，0、24 h光学显微镜下拍照(10×20倍)，观察细胞迁移情况。通过软件计算细胞划痕宽度，实验重复3次并计算细胞24 h 迁移率(migration ratio,Rm)。Rm的计算公式：

Rm=(l0 h-l24 h)/l0 h。

式中l0 h、l24 h分别表示0、24 h划痕宽度。

2.4 Matrigel transwell实验检测细胞侵袭能力 将BD胶和预冷的无血清DMEM培养液按1∶3比例稀释混匀，取100 μL均匀地铺在带有8 μm孔径聚碳酸酯膜的Transwell小室内，并放置在37 ℃恒温培养箱中静置1 h，使BD胶凝固。将Matrigel transwell小室至于24孔板中，同时下室加入含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养液。调整细胞浓度至1.0×106/mL，Transwell上室内加入细胞悬液100 μL。在恒温细胞培养箱中孵育6 h待其贴壁后，加入不同浓度RPTS(0、2.5、5、10 μg/mL)继续培养24 h,每组设置3个复孔。取出Matrigel transwell小室，用棉签小心擦去小室上层未迁移细胞，并用PBS清洗3次后，用0.1%结晶紫在室温染色20 min。用PBS清洗3次。每组随机选取5个不同高倍视野(10×20倍)计细胞数。实验重复3次。

3 结果

3.1 RPTS对人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响 实验结果表明RPTS(10、20、40 μg/mL)处理SGC-7901细胞24 h之后，有明显抑制作用(P<0.05)，随着浓度的升高，细胞的增殖率逐渐减少。但RPTS(2.5、5 μg/mL)组与空白对照组相比，OD值差异并无统计学意义，说明RPTS(2.5、5 μg/mL)对细胞增殖没有明显抑制作用，结果见图1。因此为尽量减少RPTS对细胞毒性作用的影响，筛选RPTS(2.5、5、10 μg/mL)作为后续药效学实验研究。

3.2 RPTS对人胃癌细胞SGC-7901迁移能力的影响 划痕实验结果显示，2.5、5、10 μg/mL浓度RPTS给药组处理细胞24 h后，划痕距离明显大于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而且RPTS的迁移抑制作用呈浓度依赖关系，结果见图2、图3。

3.3 RPTS对人胃癌细胞SGC-7901侵袭能力的影响 Matrigel transwell小室下室细胞经结晶紫染色，在Olympus BX51倒置荧光下观察，可以看出2.5～10 μg/mL浓度RPTS给药组，下室侵袭细胞数量明显减少，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。且随着RTPS浓度的增加，侵袭细胞数逐渐减少，表现出剂量依赖关系。结果见图4、图5。

注：与0 μg/mL RPTS组比较，*P<0.05

注：与0 μg/mL RPTS组比较，*P<0.05

4 讨论

肿瘤可以侵袭和转移到相距很远的组织和器官当中。对于还没有形成远距离转移的肿瘤而言，其治愈率可以达到90%[12]。然而当肿瘤细胞转移至其他组织，现代医疗水平很难达到理想的治疗效果。

在临床上，肿瘤细胞发生侵袭和转移是多步骤、多阶段的综合过程，一般要经过肿瘤管道的生成、形态改变、运动能力的增加、分泌蛋白酶、降解基底膜、在管道中运输、继发器官的生长等步骤[13]。而胃癌细胞的转移更是涉及血管、淋巴转移、腹腔的种植性转移，以及肝脏的转移，这些不可预期的转移途径是导致患者术后复发和大多数胃癌患者死亡的主要原因。现代肿瘤学和分子生物学研究表明，胃癌细胞黏膜下层的浸润深度以及转移的过程十分复杂,不仅与肿瘤的病理分型和组织分化程度紧密相关，而且还涉及到多条信号转导通路和多层次的交叉调控。

注：A. RPTS 0 μg/mL组；B. RPTS 2.5 μg/mL组；C. RPTS 5 μg/mL组；D. RPTS 10 μg/mL组

图4倒置荧光显微镜下观察RPTS对人胃癌细胞SGC-7901体外侵袭能力的影响(10×20倍)

本实验在前期研究RPTS抗人胃癌细胞增殖活性基础上，进一步探索了RPTS对人胃癌细胞迁移和侵袭的能力。本研究发现，RPTS 10、20、40 g/mL剂量组具有较好的体外抗人胃癌细胞SGC-7901增殖的活性。为尽量减少RPTS对细胞毒性作用的影响，笔者筛选RPTS 2.5、5、10 μg/mL剂量组进行划痕和Transwell实验研究，结果发现RPTS表现出较好的抑制SGC-7901细胞迁移和侵袭的作用，且呈现出剂量依赖关系。

注：与空白对照组比较，*P<0.05

综上所述，RPTS可抑制人胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的过程，其分子学机制有待进一步研究。