林水城, 胡可慧, 刘云辉, 黄小红

(福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室，福建 福州 350002 )

筋骨草(AjugadecumbensThunb),别名白毛夏枯草、金疮小草、破血丹等，为管状花目唇形科筋骨草属多年生草本,其根部膨大,直立,无匍匐茎.筋骨草为药用植物,性味苦寒,有镇咳、祛痰、平喘等功效.研究表明,筋骨草具有抗菌、抗病毒、抗氧化等功能[1-2],同时还具有抗炎的药用价值[3].

急性肺损伤是由严重感染、创伤、脓毒症等多种因素引起的弥漫性的肺实质损伤,临床上表现为顽固性低血氧症和呼吸窘迫,其发展至严重阶段时被称为急性呼吸道窘迫综合征,临床上发病率高,死亡率高达30%～50%.细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作为急性肺损伤的主要致病因素之一,可以诱导相应的宿主效应细胞(单细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等)产生大量炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α等),而这些炎性因子的诱生、相互作用、炎症效应与细胞内信号传导通路密切相关[4].由于急性肺损伤复杂的发病机制,至今还没有有效的治疗药物.现阶段,关于筋骨草超微粉在急性肺损伤肉鸡的应用上尚未见报道.为此，本试验采用气管注射LPS的方法建立鸡急性肺损伤模型,观察筋骨草超微粉对鸡急性肺损伤的防治效应,并初步探讨其抗炎作用机制.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料 筋骨草超微粉购自福建中农牧生物药业有限公司,其有效活性成分乙酰哈巴苷的含量为0.62%.

1.1.2 试验动物 200只1日龄艾维茵白羽肉鸡购自福建圣农集团有限公司.

1.1.3 试剂 NO测试盒、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)测试盒、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)测试盒均购自南京建成生物工程研究所;LPS购自Sigma公司;GoScriptTMReverse Transcription reaction试剂盒、GoTaq®qPCR Master Mix荧光试剂盒购自PROMEGA公司;TRIzol购自LIFE公司;氯仿、异丙醇、75%乙醇均为分析纯.

1.1.4 仪器与设备 主要仪器与设备有VIS-7200 型可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司)、iMARK型酶标仪(美国BIO-RAD公司)、CFX-96型荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司).

1.2 试验设计

将200只1日龄白羽肉鸡随机分为5组(空白对照组、模型组、试验Ⅰ～Ⅲ组),每组5个重复,每个重复8只鸡.空白对照组、模型组饲喂基础日粮;试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组在饲喂的基础日粮中分别添加500、1 000、2 000 mg·kg-1筋骨草超微粉.基础日粮组成及营养水平见表1,日粮均制成粉状.试验鸡笼养,让其自由采食与饮水,按肉鸡一般免疫程序免疫.试验在福建省农业科学院动物营养试验场进行,分两个阶段,试验前期1～21 d,试验后期22～42 d,为期42 d.

表1 基础日粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)

1)第1～21天的预混料为每千克日粮提供9 800 IU VA、2 780 IU VD、19.6 IU VE、2.24 mg VK3、1.4 mg VB1、7 mg VB2、33.6 mg VB3、9.8 mg VB5、3.36 mg VB6、0.056 mg生物素、1.12 mg叶酸、0.016 8 mg VB12、1 300 mg胆碱、8 mg铜、100 mg铁、120 mg锰、100 mg锌、0.3 mg硒、0.7 mg碘；第22～42天的预混料为每千克日粮提供7 000 IU VA、2 700 IU VD、14 IU VE、1.6 mg VK、1 mg VB1、5 mg VB2、24 mg VB3、7 mg VB5、2.4 mg VB6、0.04 mg生物素、0.8 mg叶酸、0.016 8 mg VB12、1 000 mg胆碱、8 mg铜、100.2 mg铁、120 mg锰、100.1 mg锌、0.3 mg硒、0.7 mg碘.

1.3 急性肺损伤模型的建立

试验第42天时,将鸡用乙醚麻醉后,分别对模型组、试验Ⅰ～Ⅲ组鸡用1 mL注射器穿透咽喉部软骨向气管注入用磷酸盐缓冲液溶解的LPS,每只鸡的给药量为0.2 mg·kg-1,空白对照组注入同等体积的磷酸盐缓冲液.

1.4 样品的采集与处理

在注射LPS的第0、12、24小时,分别从试验组、模型组、空白对照组每个重复组中随机抽取1只鸡进行采血,采血前空腹12 h,翅下静脉采血,每次每只抽取10 mL全血置于离心管中,在4 ℃、3 500 r·min-1下离心10 min,分离血清,分装于Eppendorf管中,置冰箱(-20 ℃)中保存,用于NO、NOS指标的测定.采血完毕后颈部放血处死,采集肺组织,并取一小块用4%多聚甲醛固定做切片标本,其余保存在冰箱(-80 ℃)中,用于其他指标的检测.

1.5 指标的测定

1.5.1 血清NO、NOS指标的测定 NO浓度、NOS活性采用比色法测定,按试剂盒说明书的步骤进行.

1.5.2 肺组织病理学检测 肺组织采用常规石蜡包埋处理，切片厚5 μm，HE染色，于光镜下观察肺损伤的程度.

1.5.3 细胞因子的测定 采用ELISA法检测肺组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量,按试剂盒说明书的步骤进行.

1.5.4 MPO活性的测定 采用比色法测定MPO活性,按试剂盒说明书的步骤进行.

1.5.5 肺组织中核蛋白质NF-κBp65含量的测定 采用ELISA法检测NF-κBp65的含量，按试剂盒说明书的步骤进行.

1.5.6 肺组织chTLR4、NF-κBmRNA表达水平的检测 (1)总RNA的提取:取右下肺组织50 mg,采用Trizol试剂提取肺组织总RNA.(2)cDNA的合成:RNA样本的浓度、纯度经检测(D260nm/D280nm=1.8～2.0)后,用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，采用GoScriptTMReverse Transcription reaction试剂盒将提取的RNA按试剂盒说明书的方法反转录为cDNA.(3)qRT-PCR检测:反应体系12.5 μL,含1 μL cDNA、上下游引物各0.25 μL、6.25 μL GoTaq®qPCR Master Mix、0.25 μL CRX Reference Dye、4.5 μL无核酸酶水.反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环.引物序列及扩增长度见表2.

表2 基因扩增引物序列及产物长度Table 2 Gene amplification primer sequences and product lengths

1.6 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示，用SPSS 2.0软件进行单因素方差分析、Duncan多重比较.

2 结果与分析

2.1 各处理组肉鸡肺组织的病理形态

光镜观察结果显示:与空白对照组相比,模型组肉鸡肺泡壁增厚,肺间质变宽并有大量炎性细胞浸润,肺泡腔内有炎性渗出物,肺呼吸毛细管腔受到挤压变小,甚至消失(图1B箭头所示);试验Ⅰ～Ⅲ组肺组织病理形态变化较模型组轻,肺泡壁厚度、肺间质宽度改变较小,肺组织结构破坏程度较轻(图1C、1D、1E箭头所示).

A:空白对照组;B:模型组;C:试验Ⅰ组;D:试验Ⅱ组;E:试验Ⅲ组(箭头示病变位置).图1 肺组织的主要病理变化Fig.1 Main histopathologic changes in the lung tissues with acute injury

2.2 筋骨草超微粉对急性肺损伤肉鸡血清NO浓度、NOS活性的影响

由表3可知:注射LPS 0 h,各试验组肉鸡血清的NO浓度、NOS活性差异不显著(P>0.05);注射LPS 12 h,与空白对照组比较,模型组、试验Ⅰ～Ⅲ组的NO浓度、NOS活性均显著提高(P<0.05),但试验Ⅰ～Ⅲ组的NO浓度、NOS活性显著低于模型组(P<0.05);注射LPS 24 h,NO浓度、NOS活性呈现与12 h相同的变化趋势.

表3 筋骨草超微粉对急性肺损伤肉鸡血清NO浓度、NOS活性的影响1)Table 3 Effects of A.decumbens ultramicro powder on the serum NO level and NOS activity of broilers with acute lung injury

1)同列数据后附不同字母者表示差异显著(P<0.05),附相同字母者表示差异不显著(P>0.05).

2.3 筋骨草超微粉对急性肺损伤肉鸡炎性细胞因子含量的影响

由表4可知:注射LPS 0 h,试验Ⅱ组肉鸡炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量与空白对照组、模型组的差异显著(P<0.05);注射LPS 12 h，模型组的IL-1β、IL-6、TNF-α含量较空白对照组显著提高(P<0.05),试验Ⅰ～Ⅲ组较模型组显著降低(P<0.05);注射LPS 24 h,模型组的IL-1β、IL-6、TNF-α含量较空白对照组显著提高(P<0.05),试验Ⅰ～Ⅲ组较模型组显著降低(P<0.05).

表4 筋骨草超微粉对急性肺损伤肉鸡炎性细胞因子含量、MPO活性、NF-κBp65含量的影响1)Table 4 Effects of A.decumbens ultramicro powder on the inflammatory cytokines levels，MPO activity and NF-κBp65 contents in broiler lung with acute injury

1)同列数据后附不同字母者表示差异显著(P<0.05),附相同字母者表示差异不显著(P>0.05).

2.4 筋骨草超微粉对急性肺损伤肉鸡肺组织MPO活性的影响

由表4可知:注射LPS 12 h,模型组肉鸡肺组织的MPO活性较空白对照组显著提高(P<0.05),试验Ⅰ～Ⅲ组较模型组显著降低(P<0.05);注射LPS 24 h,模型组的MPO活性较空白对照组显著提高(P<0.05),试验Ⅰ～Ⅲ组较模型组显著降低(P<0.05).

2.5 筋骨草超微粉对急性肺损伤肉鸡肺组织核蛋白质中NF-κBp65含量的影响

由表4可知:注射LPS 12 h,模型组肉鸡肺组织核蛋白质中的NF-κBp65含量较空白对照组显著提高(P<0.05),试验Ⅰ～Ⅲ组较模型组显著降低(P<0.05);注射LPS 24 h,模型组的NF-κBp65含量较空白对照组显著提高(P<0.05),试验Ⅰ～Ⅲ组较模型组显著降低(P<0.05).

2.6 筋骨草超微粉对急性肺损伤肉鸡肺组织chTLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达水平的影响

由图2可知:注射LPS 0 h,各试验组肉鸡肺组织chTLR4 mRNA的表达量差异不显著(P>0.05);注射LPS 12、24 h,模型组、试验Ⅰ～Ⅲ组的chTLR4 mRNA表达量较空白对照组显著提高(P<0.05),试验Ⅰ～Ⅲ组较模型组显著降低(P<0.05).注射LPS 0 h,各试验组肉鸡肺组织NF-κB mRNA的表达量差异不显著(P>0.05);注射LPS 12、24 h,模型组、试验Ⅰ～Ⅲ组的NF-κB mRNA表达量较空白对照组显著提高(P<0.05),其中,注射LPS 24 h,试验Ⅰ、Ⅱ组较模型组显著降低(P<0.05).

图柱上附不同字母者表示差异显著(P<0.05),附相同字母者表示差异不显著(P>0.05).图2 筋骨草超微粉对急性肺损伤肉鸡肺组织chTLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达量的影响Fig.2 Effects of A.decumbens ultramicro powder on mRNA expressions of chTLR4 and NF-κB in the broiler lung with acute injury

3 讨论

3.1 筋骨草超微粉对急性肺损伤肉鸡血清NO浓度、NOS活性的影响

NO是细胞间及细胞内重要的信息物质和效应分子,在机体的生理和病理过程中起着重要的作用.体内NO合成过多，会与超氧阴离子发生反应，生成具有细胞毒性的羟自由基和过氧硝基阴离子，进而导致细胞损伤[5].NOS是NO反应通路的限速酶，通过催化L-精氨酸生成NO.当受到外界刺激处于应激状态时，巨噬细胞内的iNOS表达增多，产生大量的NO和过氧化物，两者可生成具有强氧化性的过氧化亚硝基，对细胞产生毒性作用[6].研究表明，小鼠尾静脉注射LPS后，其血清和肺灌洗液中的NO2-/NO3-水平显著升高，表明在LPS致小鼠急性肺损伤的过程中有过氧化损伤的参与[7].本试验结果显示，注射LPS 0 h，各处理组血清的NO浓度、NOS活性差异不显著(P>0.05)，注射LPS 12、24 h，NO浓度、NOS活性升高，试验Ⅰ～Ⅲ组的NO浓度、NOS活性明显低于模型组.表明筋骨草超微粉能够缓解LPS诱导的急性肺损伤.

3.2 筋骨草超微粉对急性肺损伤肉鸡免疫功能的影响

LPS是革兰氏阴性菌膜结构的物质，进入动物机体内能够与相应的宿主效应细胞(单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞)相互作用，刺激淋巴细胞释放炎性细胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α)，引起炎症反应，并激活免疫系统，导致机体厌食、嗜睡和发热等免疫应激临床症状[8-9].现代研究中，这些炎症因子和临床症状多作为实际生产中免疫应激发生的参考指标.因此，LPS模型能够作为研究肉鸡急性肺损伤的模型.

IL-1β、IL-6是具有多种生物学活性的细胞因子.在生理状态下，IL-1β促进B细胞增殖分化，发挥免疫调节作用；IL-6具有介导中枢免疫、修复神经和抗炎症反应的作用.在炎症状态下，IL-1β、IL-6含量异常增高，激活补体及T细胞增殖，产生细胞毒害，同时诱发其他促炎因子的产生，加剧炎症反应[10].TNF-α是具有抗病毒感染、激活巨噬细胞和调节机体免疫应答等多功能的细胞因子.在生理状态下，TNF-α具有抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节的作用.在炎症状态下，TNF-α含量短期内迅速升高，导致中性粒细胞向发生炎症的部位聚集，引起炎症的扩大[11-12].本试验中，注射LPS 12、24 h，模型组的IL-1β、IL-6、TNF-α含量较空白对照组显著升高(P<0.05)，表明试验动物已进入肺损伤状态，这与罗刚等[13]、石君霞等[14]的研究结果基本一致.本试验结果显示，注射LPS 0 h，试验Ⅰ～Ⅲ组的IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高，表明筋骨草超微粉能增强肉鸡的免疫调节功能；注射LPS 12、24 h，试验Ⅰ～Ⅲ组均能有效延缓LPS导致的炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量的升高(P<0.05)，表明筋骨草超微粉可以通过调节机体免疫系统的途径对急性肺损伤肉鸡的肺组织起到保护作用，以试验Ⅱ组的保护效果最佳.

MPO是反映中性粒细胞浸润和聚集程度的一个指标，其活性变化是组织炎症发展的重要过程[15].本试验中，注射LPS 12、24 h，模型组的MPO活性较空白对照组显著提高(P<0.05)，这与章卓等[16]、李莺等[17]、邢海波等[18]的研究结果一致.本试验结果显示：注射LPS 0 h，各处理组的MPO活性差异不显著(P>0.05)；注射LPS 12、24 h，试验Ⅰ～Ⅲ组均能显著降低MPO活性(P<0.05).表明筋骨草超微粉能够延缓肉鸡肺损伤过程中MPO活性的升高，减轻炎症反应.

NF-κB是调控炎症介质表达的关键转录因子，其最大的亚基p65经活化后参与炎症基因的转录，间接代表NF-κB的活化水平[19].本试验中，注射LPS 12、24 h，模型组的NF-κBp65含量较空白对照组显著升高(P<0.05)，这与徐世军等[20]的研究结果基本一致.本试验结果显示：注射LPS 0 h，各试验组之间的NF-κBp65含量差异不显著(P>0.05)；注射LPS 12、24 h，试验Ⅰ～Ⅲ组均能显著降低NF-κBp65含量(P<0.05)，提示筋骨草超微粉可以通过影响核转录因子κB的活性来延缓炎症的发生.

3.3 筋骨草超微粉对急性肺损伤肉鸡肺组织chTLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达水平的影响

Toll样受体(Toll like receptor, TLR)是一类天然免疫受体，主要表达于多形核细胞、单核细胞和巨噬细胞等表面，其中的TLR4是介导内毒素/LPS应答最主要的受体[21].LPS与细胞表面的TLR4结合，TLR4聚合将信号转导至细胞内，在细胞内经过一系列的反应，最终激活NF-κB并转移到细胞核内，诱导各种炎性细胞因子的表达[22].本试验中，注射LPS 12、24 h，模型组的chTLR4 mRNA、NF-κB mRNA的表达量较空白对照组显著升高(P<0.05)，这与黄继义等[23]的研究结果基本一致.本试验结果显示:注射LPS 0 h，各试验组之间的chTLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达量差异不显著(P>0.05)；注射LPS 12、24 h，试验Ⅰ～Ⅲ组均能显著降低chTLR4 mRNA的表达量(P<0.05)；注射LPS 24 h，试验Ⅰ、Ⅱ组均显著降低NF-κB mRNA的表达量(P<0.05).以上结果提示，筋骨草超微粉能够通过抑制TLR4/NF-κB炎症信号通路减轻炎症反应.

4 结论

在肉鸡基础日粮中添加筋骨草超微粉有利于缓解由LPS刺激引起的急性肺损伤.本试验条件下，筋骨草超微粉在肉鸡饲粮中的适宜添加量为1 000 mg·kg-1.