唐秀华, 孙威江, 洪瑶新, 谢 凤,4, 陈佳佳,4, 陈志丹

(1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002;2.福建茶叶进出口有限责任公司，福建 福州 350014;3.福建农林大学安溪茶学院，福建 泉州 362400;4.福建省茶产业工程技术研究中心，福建 福州 350002)

茶树[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]，是山茶科山茶属茶种植物，属于异花授粉植物.茶树种质资源极其丰富，与其他植物一样，茶树也存在不同叶色的现象，有常规绿叶色系、紫化色系和白化色系等，我国茶树品种(系)和茶类逐步走向“五颜六色”的发展格局.常规绿叶茶树品种(系)种植历史悠久，紫化茶树是指一芽二叶后仍能表现出紫红色的典型特征的茶树，而一芽二叶前呈紫红色，而后呈绿色的不属于紫化茶树.紫化茶树因富含花青素，嫩梢芽叶的色泽以紫、红色为主，为特异茶树种质资源.白化茶树根据叶色的不同，分为白色、黄色和复色等三大色系，其共同特点为叶绿素含量比常规绿叶茶树低[1-3].茶多酚是茶树特有的功能成分，包含儿茶素类(黄烷醇类)、黄酮及黄酮醇类、花青素及花白素类、酚酸及缩酚酸类.除酚酸及缩酚酸类外，其他3种茶多酚类型组分均具有2-苯基苯并吡喃的基本化学结构，统称为类黄酮化合物[4-5].类黄酮化合物对茶树具有特殊的抗逆生理功能，是一类重要的次级代谢产物[6]，其生物合成途径大致分为3个步骤：第一步骤合成莽草酸；第二步骤形成苯丙酸盐，以苯丙氨酸为底物，通过上游结构基因苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、桂皮酸(肉桂酸)-4-羟化酶(cinnamic acid-4-hydroxylase, C4H)和4-香豆酰CoA连接酶(4CL)共同催化完成；第三步骤形成类黄酮化合物，由中下游结构基因查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase, F3H)、类黄酮-3′-羟化酶(flavonoid-3′-hydroxylase, F3′H)、类黄酮-3′5′-羟化酶(flavonoid-3′5′-hydroxylase, F3′5′H)、二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol reductase, DFR)、无色花青素还原酶(LAR)、花青素合成酶(anthocyanin synthase, ANS)和花青素还原酶(ANR)等相互作用完成[7-8].

目前，在菜花(BrassicaoleraceaL. var.botrytisL.)[9]、小麦(TriticumaestivumL.)[10]和洋葱(AlliumcepaL.)[11]等作物上均有比较不同色系的类黄酮化合物含量差异的研究.花青素属于类黄酮化合物[3].李海芬等[12]、殷剑美等[13]分别在花生和山药上研究不同色系中花青素合成相关基因表达量的差异；唐秀华等[14]研究常规绿叶茶树(‘朝阳’、‘水仙’、‘武夷奇种83’)、紫化茶树(‘武夷奇种C18’、‘武夷奇种73’)、白化茶树(‘白鸡冠’、‘御金香’)等不同叶色茶树品种(系)的花青素总量以及PALs基因家族成员的表达量，发现紫化茶树品种(系)中的花青素总量以及PALa、PALc、PAL3(PALe)基因的表达量均显著高于常规绿叶茶树和白化茶树品种(系).目前，除了PALs基因外，花青素合成的其他相关基因的表达情况尚未见报道，为此，本试验采用实时荧光定量PCR技术检测不同叶色茶树品种(系)花青素合成相关基因的表达情况，旨在为进一步挖掘茶树种质资源的优异基因提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为常规绿叶茶树(‘朝阳’、‘水仙’)、紫化茶树(‘武夷奇种C18’、‘武夷奇种73’)和白化茶树(‘白鸡冠’、‘御金香’)等6个品种(系) (图1)，由武夷星茶业有限公司提供.按照五点采样法采摘一芽二叶，将样品混合均匀.

1:‘朝阳’；2:‘水仙’；3:‘武夷奇种C18’；4:‘武夷奇种73’；5:‘白鸡冠’；6:‘御金香’.图1 不同叶色的茶树品种(系)Fig.1 C.sinensis varieties with different leaf colors

1.2 方法

1.2.1 茶树总RNA的提取及cDNA的合成 采用植物RNA提取试剂盒(美国OMEGA公司)提取茶树总RNA，制备1%琼脂糖凝胶板用于检测RNA条带的完整性.取茶树总RNA样品1 μL，置于核酸测定仪检测其浓度，根据D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm来判断RNA的浓度和纯度.通过GoScript反转录系统，反转录合成cDNA.

1.2.2 花青素合成相关基因表达量的测定 以GAPDH为内参基因[15]，根据实时荧光定量PCR引物的设计要求获得茶树花青素合成相关基因的引物(表1).参照 SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ (Tli RNaseH Plus) Kit (TaKaRa公司)试剂盒的操作步骤进行实时荧光定量PCR检测.加样体系10 μL，含5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (2×) 、1 μL模板、10 μmol·L-1上下游引物各0.2 μL，最后用ddH2O补足至10 μL.反应程序(2步法PCR扩增标准程序)：94 ℃预变性 30 s,94 ℃变性5 s,60 ℃复性30 s(共40循环).

采用2-△△CT法处理数据，通过SPSS Statistics 17软件对结果进行单因素分析显著性差异[12].

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 结果与分析

图2显示，各结构基因在不同叶色的茶树品种(系)中均有表达，且表达量存在差异.C4H、F3′H、DFR和ANS基因在‘武夷奇种73’中的表达量最高，CHS基因在‘御金香’中的表达量最高，CHI和F3′5′H基因在‘武夷奇种C18’中的表达量最高，F3H基因在‘白鸡冠’中的表达量最高.可推测在不同叶色的茶树品种(系)中，C4H、F3′H和ANS基因在紫化茶树中的相对表达量均显著高于常规绿叶茶树和白化茶树，其他基因未呈现明显的规律.表明C4H、F3′H和ANS基因在紫化茶树中均呈上调表达，其中，ANS基因在紫化茶树中的表达量极显著高于其他两种叶色的茶树，此结果与紫化茶树中花青素含量显著高于其他两种叶色茶树的结果[14]一致，可推测ANS基因的上调表达可能促进茶树花青素的合成与积累.ANS基因是将无色花青素转变为有色花青素的关键酶基因，ANS基因的过量表达一般会增加转基因植株花青素的含量，为丰富园艺色彩和天然色素的生产研究提供帮助[16].

图柱上附不同字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同字母者表示差异不显著(P>0.05).1:‘朝阳’；2:‘水仙’；3:‘武夷奇种C18’；4:‘武夷奇种73’；5:‘白鸡冠’；6:‘御金香’.图2 花青素合成相关基因在不同叶色茶树品种(系)中的表达量Fig.2 Relative expression levels of genes associated with anthocyanin synthesis in C.sinensis varieties with different leaf colors

3 讨论

不同植物花青素生物合成途径相关结构基因的转录水平存在差异.研究表明，三叶海棠红色系叶片中CHS、DFR和ANS基因的相对表达量明显高于绿色系和黄色系叶片[17]；红色系水母雪莲中CHS、F3′H、DFR和ANS基因的相对表达量明显高于白色系和绿色系水母雪莲，是红色系水母雪莲花青素含量高的原因[18-19].李文建等[20]研究建兰花色形成的分子调控机理，发现PAL、C4H、CHS、DFR和ANS基因在红色花瓣中催化查尔酮和花青素化合物合成的结构基因的表达量均较黄绿色花瓣显著上调，推测此类基因可能与建兰花色形成有关.

唐秀华等[14]研究表明，茶树PALs基因家族成员中PALa、PALc、PAL3(PALe)基因在紫化茶树中的表达量显著高于常规绿叶茶树和白化茶树.本试验结果表明，C4H、F3′H和ANS基因在紫化茶树中的表达量显著高于其他两种叶色的茶树.其中，ANS基因的上调表达最为明显，ANS是植物花青素生物合成途径的下游结构基因中的一个关键酶，它催化无色花青素转变为有色花青素[3]，因此可推测茶树ANS基因是合成花青素的关键结构基因.李琴[21]研究推测，DFR和ANS基因是影响三色堇花斑形成的关键基因.殷剑美等[13]研究表明，ANS和类黄酮糖基转移酶(UFGT)基因在紫色山药中高度表达，而在白色山药中低量表达或不表达.钟淮钦等[22]研究不同叶色鸡爪槭ANS基因的表达情况，发现ANS基因在红色叶片中的表达量较高，在略带红色的黄色和绿色叶片中微量表达，在绿色叶片中不表达，因此推测ANS基因调控花青素的合成与积累，在植物呈色方面起关键作用.ANS基因的表达不仅调控叶色和花色等颜色性状的形成外，还参与植物的生长防御和抗氧化能力等重要生理功能，有关这方面的研究有待进一步进行.

此外，针对进一步探究茶树花青素的分子调控机理提出以下观点：(1)增加常规绿叶色系、紫化色系和白化色系3种色系茶树品种(系)的实验样品量，以便更充分地总结出花青素含量与花青素合成相关结构基因的表达规律；(2)应用液质联用(HPLC-MS)技术研究这3种不同叶色茶树品种(系)的花青素组分，更系统地阐释花青素代谢产物与茶树品种(系)叶片色泽的关系；(3)研究这3种不同叶色茶树品种(系)的抗氧化能力，寻找茶树抗氧化性与花青素的变化规律；(4)进一步克隆与花青素合成积累显著相关的结构基因，验证其功能性；(5)进一步研究类黄酮途径中花白素的下游基因表达量.