刘运镇　桂文龙　温思怡　谢昕芳

摘要 2018年8月，江苏省苏中地区某猪场出现疑似感染猪链球菌，病理剖检可见发病猪表现为脑膜、肺脏、肾脏、淋巴结出血肿胀，关节腔有纤维素性渗出物等病理变化，取鼻、肺、脑等组织进行细菌鲜血培养基分离培养24 h可见不同的溶血现象;染色镜检可见紫色成对、短链或长链排列的球菌;生化试验对乳糖、海藻糖、七叶苷产酸产气，甘露醇、山梨醇等不反应;经PCR检测最终确诊该猪场为Ⅱ型猪链球菌感染。药敏试验结果表明，该猪场猪链球菌对庆大霉素等常规药物不敏感，而对头孢曲松、氨苄西林具有较强的敏感性。

关键词 Ⅱ型链球菌;药敏试验;分离;鉴定; PCR

中图分类号 S858.28文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）21-0102-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.030

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation，Identification and Drug Sensitivity Test of Streptococcus suis Type 2

LIU Yunzhen， GUI Wenlong， WEN Siyi et al

（Jiangsu Agrianimal Vocational College， Taizhou，Jiangsu  225300）

Abstract In August of 2018， a pig farm in central area of Jiangsu Province was suspected to be infected with Streptococcus suis. Pathological examination revealed that the pigs were manifested as following： the meninges， lungs， kidneys and lymph nodes were hemorrhagic and swollen， and there were cellulosic exudates in the articular cavity;the tissues of nose， lung and brain were isolated and cultured on bacterial blood culture medium， and different hemolysis phenomena were observed 24 hours later;the purple， paired， shortchain or longchain cocci were seen by staining microscopy;biochemical experiments showed that it produced acid and gas from lactose， trehalose and aescin. Mannitol and sorbitol did not react;the infection of S.suis type 2 was finally diagnosed by PCR. At the same time， the dug sensitivity test showed that S.suis was not susceptible to routine drugs such as gentamicin， and had strong susceptibility to ceftriaxone and ampicillin.

Key words Streptococcus suis type 2;Drug sensitivity test;Isolation;Identification;PCR

基金項目 江苏省大学生创新创业训练计划项目;常州金牧药业有限公司产学研合作项目（00010114011）。

作者简介 刘运镇（1978—），男，江苏邳州人，讲师，硕士，从事兽医临床研究。通信作者，副教授，硕士，从事动物传染病研究。

收稿日期 2019-05-16;修回日期 2019-05-28

猪链球菌病是由致病性猪链球菌感染引起的一种人畜共患病[1]。猪链球菌是猪的一种常见和重要病原体，发病猪主要表现为脑膜炎、心内膜炎、肺炎、关节炎和败血症等症状。少部分患者发生链球菌中毒性休克综合征，严重病例病情进展非常快，如果诊断、治疗不及时，预后较差，病死率极高[2-4] ，对我国养猪业有很大的影响，目前我国抗生素主要用于猪链球菌疾病的预防和治疗，由于长期使用抗生素，导致耐药性的产生，使得猪链球菌的发病率和死亡率显著上升。2018年12月，江苏某猪场发生疑似猪链球菌病例。笔者通过细菌分离培养、生化试验、PCR鉴定确定为Ⅱ型猪链球菌感染，通过药敏试验确定其耐药性，为该养殖场及周边猪场猪链球菌病的防控提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集。采用李淼[5]的方法对疑似发病猪分别进行鼻腔拭子和肺脏、脑组织的采集，所有病料采集严格按照无菌操作，采集后2 h内送往实验室进行检测。

鼻腔拭子采集：对疑似发病猪的鼻孔周围，用灭菌水进行清洗后，将灭菌过的医用棉签插入鼻孔中，旋转360°后取出，放入灭菌的1.5 mL EP管中（装有含5%的无菌小牛血清的TSB培养基），封盖、标记后放于冰盒保存。肺脏采集：用灭菌过的组织剪，从喉头下端将气管剪断，连同肺脏一起取出放于封口袋中，标记后放于冰盒保存。脑组织采集：将疑似发病猪的颅骨切一方形小口，用灭菌过的组织剪将将脑组织轻轻挑出，放于封口袋中，标记后放于冰盒保存[5]。

1.1.2 试剂。 TSB肉汤培养基、小牛血清和药敏试纸（购自杭州天和生物制品有限公司）、灭菌水（自制）、哥伦比亚绵羊鲜血平板、DNA提取试剂盒、2×ES Taq MasterMix（购于上海晶抗生物工程有限公司）。

1.1.3 引物的设计与合成。

根据GenBank数据库已发表的SS基因序列，通过比对分析后找出保守序列，使用Primer Premier 5软件针对保守序列设计引物SS-F和SS-R，并以阳性样品为模板进行PCR扩增，得到预期大小为415 bp的片段[6]。对分离的猪链球菌继续进行分型检测，根据设计引物SS1-F、SS1-R、SS2-F、SS2-R、SS7-F、SS7-R、SS9-F、SS9-R进行PCR扩增，获得预期大小分别为719、524、710、569 bp的片段，见表1。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养。采用李淼[5]的方法对采集的病料进行细菌分离与培养。

鼻腔拭子的细菌分离培养：冰盒保存的鼻腔拭子1.5 mL EP管放于恒温培养箱37 ℃培养2 h后，用移液枪吸取20 μL培养液滴入哥伦比亚绵羊鲜血平板中，用灭菌接种环涂抹均匀，标记后放于37 ℃恒温培养箱中培养12 h，然后用接种环挑取具有浅绿色溶血环的疑似猪链球菌小菌落，在另外一个哥伦比亚绵羊鲜血平板中划线、标记后，将平板放于37 ℃恒温培养箱中纯培養24 h[5]。

肺脏和脑组织的细菌分离培养：用组织剪剪取0.5 g左右组织，剪碎后放入匀浆机中匀浆5 min，确保其充分打碎，然后将破碎的的组织用生理盐水1 000倍稀释，充分混合均后;用移液枪取20 μL稀释液滴入哥伦比亚绵羊鲜血平板中，用灭菌接种环涂抹均匀，标记后放于37 ℃恒温培养箱中培养12 h，然后用接种环挑取具有浅绿色溶血环的疑似猪链球菌小菌落，在另外一个哥伦比亚绵羊鲜血平板中划线、标记后，将平板放于37 ℃恒温培养箱中纯培养24 h[5]。

1.2.2 细菌的染色镜检。用灭菌接种环挑取疑似猪链球菌纯培养物菌落，采用革兰氏染色法染色，置于高倍显微镜下镜检，观察细菌形态。

1.2.3 生化试验。

将分离培养得到的菌株接种到进行甘露醇、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、七叶苷等生化反应管中，37 ℃条件下培养48 h，观察生化反应特征。

1.2.4 PCR鉴定。

参照邹君等[7]建立的多重PCR检测方法，采用煮沸裂解法制备细菌 DNA 模板。取适量的过夜培养液，以12 000 r/min离心5 min，弃去培养基，用无菌超纯水洗涤沉淀2次，并用100 μL超纯水重悬细胞。100 ℃金属水浴锅作用 10  min，置于冰浴中冷却10  min，12 000 r/min 离心 10  min，取上清液作为 DNA 模板。PCR反应体系如下：Premix Taq 12.5 μL、正向引物 0.5 μL、反向引物 0.5 μL、cDNA样品 2 μL，补ddH2O至25 μL。PCR反应程序如下：94 ℃  5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃延伸45 s，40个循环;72 ℃延伸10 min;16 ℃ 1 min。按照琼脂糖凝胶电泳SOP（编号）对PCR扩增产物进行凝胶电泳，并判断结果。

1.2.5 药敏试验。

按照CLSI M100的标准进行药物试验。用灭菌棉签刮取细菌纯培养物，使之溶解于灭菌生理盐水中，将菌落浓度调整为0.5麦氏单位，取适量菌悬液均匀涂布于MH琼脂平板上，略干后贴上药敏纸片，于37 ℃下培养18 h后，测量抑菌环直径[8]。判定标准如下：抑菌圈直径 <10 mm为耐药，抑菌圈直径 10～15 cm为中度敏感， 直径>15 mm则为高度敏感。

2 结果与分析

2.1 细菌分离结果

待检病料经过24 h培养，鼻拭子病料分离到1株可疑菌株，在鲜血培养基上菌落呈针尖大小、圆形隆起，湿润透明，灰白色，菌落周围形成完全透明的溶血圈，为β-溶血[9]。

2.2 细菌的染色镜检

在革兰氏染色后，显微镜检查显示病料培养物为球菌，呈单个、成对，短链或长链排列，且革兰氏染色为紫色（阳性），其病料组织触片镜检细菌形成对、短链、无鞭毛、无芽胞。

2.3 生化试验结果

由表2可知，3种病料培养的菌落生化特征均与链球菌生化指标相一致。

2.4 PCR鉴定结果

通过琼脂糖凝胶电泳SOP（编号）对PCR扩增产物进行电泳，扩增到524 bp大小片段，结果如图1所示。

通过PCR扩增，分离细菌基因检测结果为阳性，说明该猪场发病猪分离菌株为Ⅱ型猪链球菌。结合病理变化和生化试验结果，可确定该猪场发生Ⅱ型猪链球菌病。

注：1.Marker;2.样品;3.阳性对照（2型链球菌，524 bp）;4.阴性对照

Note：1.Marker;2.Sample;3.Positive control （S.suis type 2， 524 bp）;4.Negative control

图1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果

Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products

2.5 药敏试验结果

由表3可知，该猪场分离出的菌株对较多药物具有较强的耐药性，该分离菌株对头孢曲松、哌拉西林、氨苄西林、呋喃唑酮等药物高度敏感，而对环丙沙星、红霉素、庆大霉素、阿莫西林、诺氟沙星等药物不敏感。经调查发现该猪场在日常生产中经常采用环丙沙星、红霉素、庆大霉素等药物进行疾病防控，导致耐药性的产生。

3 讨论

对送检的病死猪病料，分别进行了猪复红细胞体、圆环病毒、弓形虫等疾病的病原体检测，检测结果为阴性，对链球菌的病原体检测从细菌分离培养、染色镜检、生化试验、PCR等方面鉴定分离到的病原为链球菌，从而確诊该猪场发生了猪链球菌病。

链球菌具有多种细菌且在自然界中广泛分布，引起许多动物（如人、猪、牛、马、绵羊和家禽等）的感染。猪链球菌的特征是败血症和局灶性淋巴结病。猪链球菌感染猪的生殖和消化道、上呼吸道。其中，以Ⅱ型猪链球菌最常见、毒性最强。致病因素包括胶囊、溶菌酶释放蛋白（MRP）、细胞外因子（EF）和溶血素。这种胶囊可以防止细菌被吞噬。溶菌酶释放蛋白和细胞外因子的存在增强了菌株的毒力。这种细菌的抵抗力不强，对干燥、湿热比较敏感，常用的消毒剂就可以杀灭它。

链球菌为革兰氏阳性菌，在理论上许多抗生素对其具有明显的抗菌作用。药敏试验结果表明，分离到的链球菌对头孢曲松、哌拉西林、氨苄西林、呋喃唑酮等药物具有较高的敏感性，而其对环丙沙星、红霉素、庆大霉素、阿莫西林、诺氟沙星等药物不敏感，主要是由于该猪场在生产过程使用了大量的抗生素，导致耐药菌株的产生。通过药敏试验筛选合适药物，结合猪场实际生产情况，确定合理的用药方案，选择合适的路径和剂量，可有效控制疫情的发生。刘佩红等[10]研究表明不同猪场对药物的耐药性也不同，也说明在猪场日常生产中进行临床用药时，应尽可能采用轮换用药、联合用药等方式，避免耐药菌株的产生[11]。

参考文献

[1] 甘孟侯，杨汉春.中国猪病学[M].北京：中国农业出版社，2005：333-336.

[2] 冯萍. 猪链球菌病[J].寄生虫病与感染性疾病， 2006， 4（1）：34-37.

[3] 陆承平. 兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社，2012：87-88.

[4] 蒋红，王宏军，周铁忠，等.银翘天甘对猪链球菌Ⅱ型病理模型的防治试验[J].中国农学通报，2012，28（29）：44-48.

[5] 李淼.猪链球菌常见血清型PCR方法的建立及应用[D].长沙：湖南农业大学，2016.

[6] 朱岩昆.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析[D].新乡：河南师范大学，2013.

[7] 邹君，王楷宬，田莉莉，等. 链球菌猪主要致病种和型多重PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学，2011，41（7）：701-706.

[8] 孙萌，白飞飞，徐丹丹，等.一株狐源猪链球菌的分离与鉴定[J].黑龙江畜牧兽医，2018（4）：206-207，242.

[9] 白昀，覃伦，龙剑明，等.猪链球菌9型的分离与鉴定[J].上海畜牧兽医通讯，2007（1）：36-37.

[10] 刘佩红，沈素芳，王永康，等. 上海地区猪源链球菌分离株的病原特性鉴定[J].中国兽医学报，2001，12（1）：42-46.

[11]  张慧，杨旭兵，董雅琴，等.某发病猪场链球菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国动物检疫，2018，35（1）：78-80，99.