崔欣萍，冯佳卉，赵春颖，赵 晴，赵 硕，刘金欣、2△

（1.承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000；2.中国医学科学院/北京协和医学院药用植物研究所）

金莲花(Trollius chinensisBge.)是毛茛科金莲花亚科多年生草本植物的干燥花及花蕾[1]。金莲花味微苦、性寒、无毒，具有清热解毒、滋补阴气、清热降火、抗菌消炎、养阴清热、消炎杀菌等功效[2]。金莲花以花入药，其形态受气候环境等多种因素影响，采用传统鉴定方法具有一定局限性。DNA条形码技术是基于遗传物质DNA对物种进行鉴定，不受生长环境、地理位置及人为因素的影响。本研究尝试建立一种基于ITS2序列的DNA条形码鉴定方法，以期为中药材金莲花的鉴定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本研究共收集11份来自河北、山西、东北等地的金莲花样品，产地信息见附表：

附表 金莲花样品产地信息

1.2 金莲花DNA的提取、PCR扩增及测序 每份样品取一朵干净无霉斑的完整花朵进行取样，每份取样30mg，利用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取总DNA。PCR扩增使用植物DNA条形码ITS2序列通用引物和程序，PCR扩增产物经纯化后，使用ABI 3730XL测序仪进行双向序列测定。依据《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》对测序峰图质量进行判断。

1.3 数据分析 利用CodonCode Aligner V7.0.1软件去除测序结果的低质量部分，并进行峰图的校对拼接，获得ITS2间隔区序列；基于隐马尔可夫模型[3](hidden Markov model )对数据进行分析，利用Hmmer V3.1软件去除5.8S区段和28S区段获得ITS2序列；利用MEGA7.0软件构建NJ系统发育树，进行物种鉴定。

2 结果

2.1 金莲花样品DNA提取结果 为考察DNA提取方法的稳定性，对编号为JLH07和JLH09的样品做了三次重复试验，共提取了15份样品的DNA。采用NanoDrop2000c型超微量分光光度计测量DNA浓度，DNA浓度平均值为186.59ng/μl，A260/A280值在1.93～2.10之间，A260/A230值在0.85～1.44之间。所有金莲花样品均成功提取DNA，且获得的DNA纯度较高。

2.2 PCR扩增产物检测结果 通过电泳及凝胶成像检测PCR产物，所有样品均可检测到明亮、清晰的条带，产物大小为480bp。电泳及凝胶图谱见图1：

图1 金莲花样品的电泳及凝胶图谱

2.3 NJ系统发育树构建 通过MEGA7.0软件构建NJ树（见图2）。将金莲花和淡紫金莲花的标准序列加入到NJ树中后，发现所有样品共分为两支，其中样品编号JLH05和JLHZ08单独聚为一支，与淡紫金莲花序列一致，其余序列与金莲花的序列一致。说明，基于ITS2的DNA条形码可以准确鉴定金莲花与淡紫金莲花。

图2 NJ系统发育树

3 讨论

中药品种繁多且混杂，加之大多以根茎叶花等部位局部入药，没有完整的植物形态，故依靠传统的鉴定方法对药材进行鉴定有一定的局限性。2010年，陈士林等[4]提出将ITS2作为药用植物通用条形码，进而发现其能对物种进行快速有效地鉴别。现如今，基于ITS2序列的DNA条形码技术已在芸香科[5]、伞形科[6]等多种科属的药用植物物种鉴定方面得到广泛应用。徐晓兰等[7]进行了山豆根基原植物及其混伪品的鉴定，结果表明ITS2序列可以很好地鉴定山豆根基原植物；石林春等[8]进行了天南星及其混伪品的鉴定，结果表明ITS2序列可以有效地鉴定天南星3种基原及其混伪品。上述研究结果均提示，ITS2序列在中药材鉴定方面有一定的优越性，为中药材的鉴定及用药安全等提供了有力支持。

本研究收集了11份金莲花样品，采用DNA条形码技术进行鉴定研究，分析获得的ITS2序列和NJ树，发现有9份样品为金莲花，2份样品为淡紫金莲花。本研究证明，基于ITS2的DNA条形码技术可以准确有效地鉴别金莲花，可为中药材金莲花的鉴定提供参考依据。