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蘑菇培养料发酵中微生物群落变化及其与温室气体排放的关系

2019-11-28 10:54:11 《江苏农业科学》 2019年18期

李艳春 叶菁 王义祥

摘要:稻草和牛粪堆制发酵是生产双孢蘑菇的重要环节,分析发酵过程中微生物群落动态变化有助于揭示培养料发酵的机理以及探讨其与温室气体排放之间的关系。以稻草和牛粪为原料,采用磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记法分析不同碳氮比(C/N=28、33、38、43)条件下发酵料在不同发酵阶段(第1次高温期、第2次高温期、一次发酵结束、二次发酵结束)的微生物群落变化。结果表明,发酵过程中共分离到24种碳链长度在12~24的PLFA;隨发酵进程加深,不同C/N处理的微生物PLFA种类和丰度都有变化,但丰度最高的9个生物标记均为i16 ∶0和a17 ∶0[革兰氏阳性菌,Gram(+)],15 ∶0和18 ∶0(细菌),18 ∶2ω6t,9t和18 ∶1ω9c(真菌),16 ∶1ω7c、16 ∶1ω9c和cy19 ∶0[革兰氏阴性菌,Gram(-)]。不同C/N处理的特征脂肪酸含量在发酵过程中均呈现出细菌>Gram(+)>真菌、Gram(-)>放线菌,并且总PLFA、细菌和Gram(+)PLFA含量均呈现出先降低后增加的趋势,然而Gram(-)和放线菌呈现出逐渐增加的趋势。在第1次和第2次高温期,随着C/N增加,总PLFA、细菌和Gram(+)PLFA含量均有增加的趋势。二次发酵结束时,C/N=33处理的总PLFA、细菌、Gram(-)、放线菌PLFA含量显著高于其他处理,C/N=38处理次之。相关性分析表明,放线菌与发酵温度、N2O排放速率均呈显著负相关。

关键词:双孢蘑菇;培养料;发酵;微生物群落;磷脂脂肪酸;温室气体排放;相关性分析

中图分类号: S141.4;S181文献标志码: A

文章编号:1002-1302(2019)18-0303-06

收稿日期:2018-06-01

基金项目:国家科技支撑计划(编号:2012BAD14B15、2012BAD14B03-05);福建省自然科学基金(编号:2015J01102)。

作者简介:李艳春(1980—),女,山西忻州人,博士,助理研究员,主要从事生态农业研究。E-mail:[email protected]

通信作者:王义祥,博士,研究员,主要从事碳氮循环研究。E-mail:[email protected]

稻草和牛粪堆制发酵是双孢蘑菇生产的第1个关键步骤,其发酵过程实质上是在稻草和牛粪的原材料混合物内通过多种有益微生物群落的新陈代谢,将原材料最终转化成为适宜双孢蘑菇生长的具有高度选择性的基质。目前一些学者已利用纯培养法、PCR-DGGE技术等对蘑菇培养料发酵过程中微生物数量变化和群落演替进行了研究[1-2],并对培养料中的嗜热放线菌和真菌进行分离、培养、遗传多样性分析[3-4]。培养料发酵过程中,碳氮比(C/N)高低影响着微生物的数量和活性,C/N过高或过低都不利于微生物的生长,进而影响碳素的转化和发酵质量[5]。此外,一些研究还表明,培养料初始C/N会影响到发酵过程中CO2、CH4等温室气体的排放量[6-7]。可见,C/N与微生物菌群生长、温室气体排放之间的关系密切。然而,目前关于C/N对发酵过程中微生物群落的影响以及微生物菌群与温室气体排放之间关系的研究还鲜见报道。

目前,较为常见的几种土壤微生物多样性的研究方法均有不足之处。传统的基于培养基的微生物技术受培养条件限制而无法研究88%~99%原位微生物[8]。BIOLOG生态板分析法有固定碳源,操作简单方便、灵敏度高,能够产生大量反映微生物代谢特征的数据。但该方法只能检测到可培养、代谢活性强的细菌,代谢活性较慢的细菌和真菌群落不能被检测到[9]。此外,基于PCR扩增(如DGGE、T-RFLP)的分子技术虽然不受微生物实验室培养的限制,可以获取相对全面的种群信息,但该技术不能区分活体与死体DNA,并且引物序列设计具有人工选择性[8]。PLFA(phospholipid fatty acid)技术,即磷脂脂肪酸方法,是依据不同类群的微生物能通过不同的生物化学代谢途径形成不同种类的磷脂脂肪酸而建立的方法。随着微生物的死亡,PLFA会迅速降解,因而PLFA技术检测到的微生物均为活体微生物,并且该方法无需培养微生物,而是通过测定磷脂脂肪酸的种类及含量即可获得微生物群落信息,是用于监测微生物群落动态变化的一种有效方法[10]。PLFA生物标记法可以较完整地检测到样品中微生物群落变化,如真菌、放线菌、革兰氏阳性菌[Gram(+)]、革兰阴性菌[Gram(-)],目前已广泛应用于环境样品微生物群落结构变化的分析[11-13]。为了探讨蘑菇培养料发酵中微生物群落动态变化及其与温室气体排放之间的关系,本研究设置不同C/N培养料处理,采用PLFA技术分析发酵过程中微生物群落结构变化,并分析微生物群落与温室气体排放速率之间的相关关系,以期揭示培养料发酵的微生物机理及其与温室气体排放之间的相关关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牛粪和稻草分别取自福建省南平市三田牧业有限公司和福建省莆田市的水稻田。发酵前,牛粪磨成粉粒状,稻草切成小段(4~6 cm长)。牛粪基本性质为有机碳44.97%、全氮1.94%、C/N 23.18、含水率11.19%;稻草基本性质为有机碳42.87%、全氮0.98%、C/N 43.74、含水率9.44%。

1.2 试验设计

本试验以稻草和牛粪(干质量比为8 ∶2)为主料,添加化肥氮源硫酸铵配制不同C/N培养料处理,每个处理重复3次,配方见表1。

1.3 发酵方法

2015年10月在福建省农业科学院农业生态研究所进行发酵试验。用于发酵的反应箱由PVC板自制而成,总容积1 200 L(100 cm×100 cm×120 cm),主要由装料箱、进料口、通气口、排水管、鼓风机、排水管、筛板等部分组成(图1)。将稻草、牛粪、(NH4)2SO4以及过磷酸钙水溶液充分混匀,调节含水率约至70%左右,放入装料箱,埋入数显温度计以监测发酵料温度。根据发酵料温度进行翻堆,第7天和第14天进行翻堆,第2次翻堆时(第14天)同时将石膏和石灰均匀拌入发酵料,整个发酵过程持续18 d。0~14 d发酵过程中顶部加盖密封,每隔4 h强制吹风15 min(800 L/min的鼓风量),此过程称为前发酵。15~18 d发酵过程中将顶部盖子打开,并且关闭鼓风机,该过程称为后发酵。

1.4 微生物群落分析

分别在发酵4、9、13、17 d采集培养料样品用于微生物群落分析,采样时间所处的发酵阶段依次为第1次高温期、第2次高温期、一次发酵结束、二次发酵结束。微生物群落结构的分析采用PLFA方法,具体分析步骤按照Wu等方法[14]。脂肪酸的命名参考Frosteg-rd等的文献[15-16],采用不同的PLFA标定特定的微生物[10]:12 ∶0、13 ∶0、15 ∶0、18 ∶0和20 ∶0 标记细菌,i14 ∶0、a15 ∶0、i16 ∶0和a17 ∶0标记Gram(+),16 ∶1ω14t、16 ∶1ω7c、16 ∶1ω9c、18 ∶1ω7t、cy17 ∶0和cy19 ∶0标记Gram(-),10Me18 ∶0和10Me19 ∶0标记放线菌,18 ∶2ω6t,9t和18 ∶1ω9c标记真菌,20 ∶4ω6c(6,9,12,15)标记原生动物。

1.5 气体采集与测定

分别在发酵4、9、13、17 d采集气体(气体采集之后进行培养料取样用于微生物分析)。温室气体采集方法和步骤如下[6]:关闭鼓风机→打开反应箱顶盖(持续交换箱内外气体30 min)→采集周边空气样品→反应箱顶盖盖好密封→30 min 后从顶盖预留的取气口采集箱内气体样品。采集的气体样品存放在0.25 L密闭气袋内,利用气相色谱仪(安捷伦7890B)进行测量。由2次采集气体的浓度差,通过公式(1)计算温室气体(CO2、CH4、N2O)的排放速率[16,19-20]。

F=ρ·V·(dC/dt)·273/(273+T)/m。(1)

式中:F为被测气体(CO2、CH4、N2O)的排放速率,mg/(kg·h);ρ为被测气体标准状态下的密度(CO2、CH4、N2O的密度分别为1.977、0.717、1.978 kg/m3);V为取样箱顶部空间的体积,m3;dC/dt表示采样箱内被测气体的浓度变化率;T表示采样过程中采样箱内的平均温度,℃;m表示培养料的质量,kg。

1.6 数据处理

方差分析和斯皮尔曼等级相关(Spearman Rank correlation)分析采用软件MATLAB 7.0。

2 结果与分析

2.1 培养料微生物PLFA信息分析

发酵过程中,共分离到24种碳链长度在12~24的PLFAs。随发酵进程加深,不同C/N处理的微生物PLFAs种类和丰度都有变化。但不同处理培养料中磷脂脂肪酸丰度最高的9个生物标记均为i14 ∶0、a15 ∶0、i16 ∶0和a17 ∶0[Gram(+)],15 ∶0和18 ∶0(细菌),18 ∶2ω6t,9和18 ∶1ω9c(真菌),cy19 ∶0[Gram(-)](图2)。

2.2 总PLFA含量变化

培养料发酵4、9、13、17 d所处的发酵阶段依次为第1次高温期(54.4~67.1 ℃)、第2次高溫期(49.2~63.7 ℃)、一次发酵结束(34.3~46.6 ℃)、二次发酵结束(42~47.4 ℃)(图3)。整个发酵过程中总PLFA含量高达1 181.25~2 365.37 nmol/g,呈现出先降低后增加的趋势。在第1次高温期,总PLFA含量较高(1 619.14~2 350.63 nmol/g),并且随着碳氮比增大而增加;在第2次高温期总PLFA含量有所降低(1 181.25~1 733.29 nmol/g),C/N=43处理显著高于其他处理;一次发酵结束时总PLFA含量有所增加,但增幅较小;二次发酵结束时总PLFA含量明显增加,C/N=28、33、38处理的总PLFA含量较第1次高温期增加了26.14%、46.09%和11.35%,而C/N=43处理的总PLFAs含量较第1次高温期减少了11.18%。

2.3 细菌PLFA含量变化

整个发酵过程中细菌PLFA含量高达907.81~1 902.65 nmol/g,占到总PLFA含量的74%以上。随发酵进程的加深,其变化趋势与总PLFA含量的变化趋势一致,呈现出先降低后升高的趋势(图4)。在第1次高温和第2次高温期,细菌PLFA含量有随C/N比增大而增加的趋势;一次发酵结束和二次发酵结束时C/N=33处理的细菌PLFA含量最高。二次发酵结束时C/N=28、33、38处理细菌PLFAs含量较第1次高温期增加了31.75%、50.62%和7.76%,而C/N=43处理总PLFAs含量较第一次高温期减少了16.41%。

2.4 Gram(+)和Gram(-)PLFA含量变化

在整个发酵过程中,Gram(+)PLFA含量都比较高,占总PLFA含量的50%以上,呈现先降低后增加的趋势(图5-a)。在第1次高温期和第2次高温期时,随C/N比的增加Gram(+)含量有增加趋势,其他发酵阶段各处理间的差异不明显。Gram(-)PLFA含量占细菌PLFA含量的8%~28%,呈现出逐渐增加的趋势(图5-b)。二次发酵结束时,C/N=28、33、38、43处理的Gram(-)PLFA含量分别比发酵初期增加了1.79、2.43、2.58、0.86倍。Gram(-)/Gram(+)比值呈逐渐增加的趋势(图5-c)。有研究表明,Gram(-)/Gram(+)可作为营养压力指标[17],比值越大说明可利用的营养物质越多。

2.5 真菌PLFA含量变化

整个发酵过程中真菌PLFA含量较低,占总PLFA含量的10%~21%。发酵4、9、17 d,C/N=28、33、38处理间的真菌含量差异不显著,但都显著低于C/N=43处理(图6)。

2.6 放线菌PLFA含量变化

整个发酵过程中放线菌PLFA含量较低,占总PLFA含量的1%~7%,呈现出逐渐增加的趋势(图7)。二次发酵结束时, C/N=28、33、38、43处理的放线菌PLFA含量分别比发酵初期增加了1.07、2.34、1.09、1.65倍。

2.7 温室气体排放速率

在培养料发酵过程中,各处理的CO2排放速率都比较高,变幅在157.48~772.21 mg/(kg·h)(表1)。随发酵时间的延长,CO2排放速率呈现出先降低后升高的趋势,这与发酵过程中进行的翻堆管理有关。在发酵9 d时,各处理间CO2排放速率差异显著(P<0.05),并且呈现出随着C/N比增加而减少的趋势。培养料发酵过程中可能会出现局部厌氧环境,此时微生物发生厌氧消化产生CH4。然而,本发酵过程中各处理的CH4排放速率都相对较低,保持在0.03~0.06 mg/(kg·h),没有明显的变化规律,说明本试验条件下通风状况良好,不易产生厌氧状况。各处理的N2O排放速率也相对较低,保持在0.01~0.06 mg/(kg·h),发酵9、13、17 d 时呈现出随C/N比增加而减少的趋势。

2.8 微生物菌群与温室气体排放、环境因子的相关性

通过对培养料中各类微生物菌群与温室气体排放速率、发酵温度、C/N比值的相关性分析发现,总PLFA和细菌、Gram(+)、真菌(PLFA含量)都与C/N比有较大的正相关性,但都未达到显著水平;放线菌PLFA含量与温度、N2O排放速率均呈显著负相关。Gram(-)PLFA含量与温度、CH4排放速率有较大的负相关性(表2)。

3 讨论与结论

双孢蘑菇培养料发酵是一个复杂的生物化学过程,整个过程是通过微生物群落不断演替来完成的。已有研究表明,在发酵初始,中温微生物利用培养料中简单有机质释放热量和CO2,使培养料升温,之后嗜热微生物成为优势群落;当培养料温度上升至60 ℃以上时,细菌大量繁殖,大量简单糖类被分解;发酵后期,随着营养物质的分解以及料温降低,放线菌及霉菌开始大量繁殖[18-19]。本研究表明,在整个发酵过程中不同处理的特征脂肪酸含量大小均为细菌>Gram(+)>真菌、Gram(-)>放线菌,并且微生物总PLFA和细菌、Gram(+)PLFA含量均呈现出先降低后增加的趋势,而Gram(-)和放线菌PLFA含量呈现出逐渐增加的趋势。因此,在此发酵过程中微生物可能的演替过程是:第1次高温期时,嗜热细菌吸收培养料基质中的可溶性糖类、蛋白质、氨基酸等快速增殖,总PLFA、细菌PLFA、Gram(+)PLFA含量较高;第2次高温期由于易降解物质耗尽,而培养料中不溶性木质素、纤维素等物质还未完全降解,因此总PLFA、细菌PLFA、Gram(+)PLFA含量大幅下降;但随着发酵的进行,放线菌逐渐增加,使得培养料中不溶性木质素、纤维素等物质逐渐降解[20],微生物可利用营养增加,在二次发酵结束时各类微生物量均显著增加。此外,利用宏基因组方法分析以稻草和玉米秸秆为主要原料堆肥生境微生物区系变化的研究中,也发现大部分放线菌都出现在堆肥的一次和二次发酵结束阶段[21],与本研究结果一致。但发酵过程中真菌含量较低且没有明显的变化趋势,其原因可能是高温发酵过程中,温度变化范围不利于真菌生长,使得大部分真菌群落处于休眠状态或死亡。

培养料堆制发酵是一个复杂的反应体系,培养料初始C/N 的大小强烈影响微生物群落组成和数量。在发酵的第1次高温期和第2次高温期,总PLFA和细菌、Gram(+)PLFA含量均呈现出随着C/N增加而增加的趋势。二次发酵结束时,C/N=33处理的总PLFA、细菌、Gram(-)、放线菌PLFA含量明显高于其他处理,C/N=38处理次之。据报道,放线菌和一些霉菌在二次发酵期间能够转化易分解的有机物,同化或挥发游离氨,消耗简单的糖类,留下大量的菌体蛋白质和腐殖质复合体,因此放线菌可作为评价堆体发酵质量的一个指标[22]。之前通過评价子实体产量和生物学效率发现C/N=33 和C/N=38处理效果最佳[6],与此结果一致。该研究从微生物学角度进一步明确了双孢蘑菇培养料发酵前最佳C/N为33 ∶1。

相关性分析表明:放线菌PLFA含量与发酵温度、N2O排放速率均呈显著负相关。可见,发酵温度、N2O排放速率是影响放线菌数量的重要因素。N2O产生于堆肥过程中铵态氮的硝化和硝态氮的反硝化过程[23],因此关于微生物与N2O排放之间的关系,需进一步从硝化细菌、反硝化细菌等功能菌方面进行研究。

本研究结果表明,发酵过程中共分离到24种碳链长度在12~24的PLFAs;随发酵进程加深,不同C/N处理的微生物PLFAs种类和丰度都有变化,但丰度最高的9个生物标记均为i14 ∶0、a15 ∶0、i16 ∶0和a17 ∶0[Gram(+)],15 ∶0和18 ∶0(细菌),18 ∶2ω6t,9t和18 ∶1ω9c(真菌),cy19 ∶0[Gram(-)]。

不同C/N处理的特征脂肪酸含量在发酵过程中均呈现出细菌>Gram(+)>真菌、革兰氏阴性菌Gram(-)>放线菌,并且总PLFAs和细菌、Gram(+)PLFAs均呈现出先降低后增加的趋势,而革兰氏阴性菌和放线菌呈现出逐渐增加的趋势。

在发酵的第1次高温期和第2次高温期,总PLFA、细菌和Gram(+)PLFA含量均呈现出随着C/N增加而增加的趋势。二次发酵结束时,C/N=33处理的总PLFA、细菌、Gram(-)、放线菌PLFA含量显著高于其他处理,C/N=38处理次之。

相关性分析表明,总PLFAs和细菌、G(+)、真菌PLFA含量都与C/N比有较大的正相关性,但均未达到显著水平;放线菌PLFA含量与发酵温度、N2O排放速率均呈显著负相关。

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