刘玉凤　马丽娟　张婷婷　马磊

摘要：土壤中的溶磷菌可增加难溶性磷酸盐的溶解性，提高植物对磷的吸收和利用。利用溶磷圈法，从红花根际土壤中，初步筛选出具有较高溶磷能力的菌株RC01，并对其培养条件进行优化。单因素试验结果表明，当葡萄糖为碳源、（NH4）2SO4为氮源，在30 ℃、0.3 g/L NaCl条件下，该菌的溶磷效果较好;正交试验结果表明，10 g/L葡萄糖、0.5 g/L （NH4）2SO4、30 ℃、0.35 g/L NaCl时，溶磷量最大。RC01经过16S rRNA測序鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas），其良好的溶磷菌特性，可为促进红花生长的相关微生物研究奠定基础。

关键词：红花;根际;溶磷菌;分离;筛选;培养条件;优化

中图分类号：S182 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）18-0287-04

收稿日期：2018-06-04

基金项目：国家自然科学基金（编号：31560310，31760302）。

作者简介：刘玉凤（1993—），女，新疆石河子人，硕士研究生，研究方向为生物信息学。E-mail：1029454784@qq.com。

通信作者：马 磊，博士，副教授，研究方向为生物信息学与分子遗传学，E-mail：malei1979@hotmail.com;张婷婷，硕士，讲师，研究方向为分子遗传学，E-mail：zting@shzu.edu.cn。

磷元素是植物生命活动所必需元素之一。植物吸收利用的磷元素主要源于土壤，而我国约有74%的耕地土壤缺磷，且土壤中95%的磷的存在形式难以被植物吸收[1]。然而，土壤中溶磷菌可将难溶性磷酸盐转化为植物可吸收磷酸盐，提高植物对磷肥的利用率，增加农作物的产量，减少土壤对磷酸盐的吸附性，避免过施磷肥环境污染[2]。溶磷菌广泛分布在根际、土壤及种子表面[3]。分离和利用土壤溶磷微生物，促进植物吸收磷元素，已成为生物肥料研究领域的热点之一，对于农业的可持续发展具有重大的意义。

红花（Carthamus tinctorius L.）是一种集药材、油料、燃料、饲料为一体的特种经济作物[4]，在农业生产中具有重要的意义。目前，国内外有关植物根际溶磷菌的研究较多，已涉及玉米[5]、春小麦、苜蓿[6]、大豆[7]等多种植物，但关于红花根际溶磷菌的研究报道较少[8]。本试验从红花根际筛选出了溶磷菌株，并对其溶磷能力进行研究，为研发促进红花生长的生物菌肥的研究奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

供试土壤采自石河子大学实验场，在红花开花期选择无病虫害、长势良好的植株，根际土壤采集采取“抖根法”[9]进行，记录采集时间、地点、土壤性质和类型，各样品按常规方法分别混合后装入灭菌信封袋，带回实验室置于4 ℃的冰箱内保存备用。

1.2 培养基

实验用培养基为蒙金娜无机磷液体培养基、固体培养基和PDA培养基。

蒙金娜无机磷液体培养基（每1 000 mL）：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，磷矿粉10 g，酵母膏0.4 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.5。

蒙金娜无机磷固体培养基：在蒙金娜无机磷液体培养基的基础上加入1.5%～2.0%的琼脂制成蒙金娜无机磷固体培养基。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL。

将马铃薯洗净去皮，切成小块后称取200 g，加水煮烂（煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可），然后用纱布过滤，将马铃薯汁滤出待用。如需制成固体培养基，可向其中加入1.5%～2.0%的琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后，再补足水分至1 000 mL，分装试管或者锥形瓶，密封，高压灭菌（121 ℃、101 kPa），20 min后保藏待用。

1.3 溶磷菌的分离与纯化

溶磷菌的培养与收集：称取10 g根际土壤置于盛有90 mL 无菌水的三角瓶中，振荡15 min（160 r/min）使土样均匀分散在无菌水中成为土壤悬液，用加样器吸取1 mL土壤悬液至盛有9 mL无菌水中的试管中，吹吸3次使之充分混匀，依次配备浓度为10-3、10-4、10-5、10-6，再从10-3、10-4、10-5、10-6稀释液中取0.1 mL溶液，均匀涂布于蒙金娜无机磷固体培养基平板上。每个浓度重复3组，于20～30 min后倒置，并放于28 ℃的恒温箱中培养。

溶磷菌株初选：观察溶磷圈，将蒙金娜无机磷固体培养基制成平板、分区，每区点植1个菌株，28 ℃培养7 d，观察有无溶磷圈生成，测定溶磷圈直径（D，cm）、菌落直径（d，cm），根据能否产生溶磷圈初步判断菌株有无溶磷能力，根据D/d大小初步确定菌株的溶磷能力的大小。

摇瓶复选及定量测定：于150 mL三角瓶中盛入蒙金娜无机磷液体培养基50 mL，高压灭菌20 min（121 ℃、101 kPa）备用。分别接种每株溶磷菌的孢子悬液1 mL于灭菌的液体培养基中，以不接菌为对照，每个处理3次重复，摇床培养（30 ℃、160 r/min）7 d，4 ℃条件下离心，取适量的上清液，采用钼锑抗比色法测定其磷含量[10]，并用酸度计测定其pH值。

1.4 培养条件的优化

采用单因素试验，分别改变培养基中碳源种类、氮源种类、温度、NaCl浓度，测量培养液中磷的含量，以确定较适宜的培养基组成。

碳源的筛选：选取溶磷效果最好的菌株进行碳源筛选试验。分别采用10 g/L葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖取代蒙金娜无机磷液体培养基的碳源，其余培养条件不变，通过试验比较得出较适宜的碳源。

氮源的筛选：分别选取0.5 g/L（NH4）2SO4、KNO3、NH4NO3、尿素取代蒙金娜无机磷液体培养基的氮源，碳源采用已试验得出的较适宜的碳源，其余培养条件不变，得出较适宜的氮源。

温度的选择：在PDA液体培养基中将待测菌株活化24 h后，按照1%的接种量接种于蒙金娜无机磷液体培养基中，于各温度梯度（20、25、30、35、40 ℃）、160 r/min的条件下培养7 d，测定培养液中磷的含量，得出最适培养温度。

NaCl浓度的选择：于150 mL三角瓶中分别盛入按不同NaCl浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L）配置的蒙金娜无机磷液体培养基各50 mL并接入菌株，其他培养条件不变，得出较适宜的NaCl浓度。

1.5 正交试验

确定菌株生长的最适培养条件为碳源为葡萄糖，氮源为（NH4）2SO4后，以葡萄糖的浓度、（NH4）2SO4的浓度、温度、NaCl浓度为4个变化因素，每个因素取3个水平，采用L9（34）正交表2进行四因素三水平试验，供试因素及水平见表1，每组处理2个重复。在PDA液体培养基中将待测菌株活化24 h后，按照1%的接种量接种于各培养基中，于各温度、160 r/min的条件下培养7 d，测定培养液中磷的含量。

提取菌体DNA，采用16S rRNA（16S ribosomal RNA）通用引物8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1 492R（5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对细菌进行PCR扩增。扩增程序：94 ℃变性5 min;然后94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35个循环;最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物送至上海生工生物技术有限公司进行16S rRNA测序，对测得序列在NCBI进行在线比对，下载相似性最高的已知菌序列，用Clustal X软件包程序对序列进行序列比对，再通过MEGA 5.05软件对所有序列构建系统发育树进行遗传鉴定。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

从蒙金娜无机磷固体培养基中筛选出3株菌，将其命名为RC01（菌落直径d=0.3 cm、溶磷圈直径D=0.4 cm）、45-3（d=0.2 cm、D=0.25 cm）、45-4（d=0.1 cm、D=0.13 cm），将具有溶磷能力的菌种RC01、45-3、45-4挑出，进行多次传代培养和纯化，淘汰掉失去溶磷能力的菌株45-4和溶磷能力比较差的菌株45-3，保存溶磷能力较强的的菌种RC01。RC01菌株在培养基上的溶磷圈如图1所示，菌株周围出现明显的透明圈，菌株呈淡黄色。

2.2 定量测定溶磷菌RC01的溶磷能力

以空白试验溶液为参照，用钼锑抗比色法定量测定溶磷菌RC01在720 nm波长的标准溶液吸光度，绘制磷标准曲线（图2）

在蒙金娜无机磷液体培养基中接种供试菌株RC01，24 h后开始测定菌液中的可溶性磷含量及菌液的pH值，然后每隔24 h测1次，其结果如图3所示。

由图3可知，随着接种时间的延长，菌株的溶磷量不断增加，120 h时菌株的溶磷量达到最大值，随后溶磷量开始下降，培养液的pH值随接种时间先不断降低，在120 h时pH值最低，随后逐渐回升至中性，结合溶磷菌的溶磷机制分析出现这一现象的原因，可能是溶磷菌RC01在生长过程中分泌了有机酸，酸性物质促进难溶性的磷矿粉释放出磷离子，在120 h 时溶磷量达到最大值（514.37 μg/mL），pH值达到最小值（5.2），说明溶磷菌RC01在培养120 h时的溶磷效果最好。

2.3 对溶磷菌RC01培养条件的优化试验

2.3.1 单因素试验

2.3.1.1 碳源的筛选

分别选取葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖作为碳源对溶磷菌RC01进行培养条件优化试验，不同碳源对溶磷菌RC01的影响如图4所示。

由圖4可知，不同碳源对溶磷菌RC01溶磷量的影响由大到小为葡萄糖>蔗糖>可溶性淀粉>麦芽糖。碳源由葡萄糖提供时，溶磷菌RC01的溶磷量达到最大（501.32 μg/mL）;碳源由麦芽糖提供时，溶磷量最小（51.73 μg/mL）。这个结果说明溶磷菌RC01对葡萄糖的利用率最大，其次依次是蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖，其中对麦芽糖的利用率最低。

2.3.1.2 氮源的筛选

分别选取（NH4）2SO4、KNO3、NH4NO3、尿素作为氮源对溶磷菌RC01进行培养条件优化实验，不同氮源对溶磷菌RC01的影响如图5所示。

由图5可知，不同氮源对溶磷菌RC01的溶磷量的影响由大到小为（NH4）2SO4>尿素>KNO3>NH4NO3，氮源由（NH4）2SO4提供时，溶磷菌RC01的溶磷量达到最大（475.36 μg/mL），氮源由NH4NO3提供时，溶磷量最小（93.80 μg/mL），说明溶磷菌RC01对（NH4）2SO4的利用率最大，其次依次是尿素、KNO3、NH4NO3，其中对NH4NO3的利用率最低。

2.3.1.3 温度的选择

在不同的温度（20、25、30、35、40 ℃）条件下，对溶磷菌RC01进行温度筛选试验，不同温度对溶磷菌RC01溶磷效果的影响如图6所示。

由图6可知，随着温度的增高，溶磷菌RC01的溶磷量先是不断升高，当温度为30 ℃时，溶磷菌RC01的溶磷量最大，随后溶磷量不断降低。