王华华 张杨阳 刘文文

摘要：在酸性（pH值<5）土壤中，铝毒害是制约农作物生产的主要逆境因子。铝毒通过抑制根系生长，影响作物对水分和营养物质的吸收，最终导致农作物产量下降。以大豆为试验材料，探讨铝胁迫下外源一氧化氮（NO）对铝毒害的调节作用。结果显示，不同铝浓度处理可抑制大豆根的生长及根尖伸长区细胞的伸长，且可诱发根尖丙二醛（MDA）和H2O2含量的升高;进一步研究结果显示，NO处理可显著缓解铝抑制的根生长及根尖伸长区细胞的伸长，且降低根尖MDA、H2O2含量，提升根尖抗氧化酶活性。表明NO可能通过提高根尖抗氧化能力来缓解铝胁迫对根尖伸长区细胞伸长的抑制，从而改善根系的生长。

关键词：大豆;根系生长;一氧化氮;信号分子;铝毒害;耐受性;生长抑制;缓解作用;抗性品种筛选

中图分类号： Q945.78;S565.101文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）18-0122-03

收稿日期：2018-06-09

基金项目：国家自然科学基金（编号：U1704121）;河南师范大学优秀青年科学基金（编号：14YQ003）;河南师范大学博士启动课题（编号：11129）。

作者简介：王华华（1980—），男，湖北孝感人，博士，副教授，主要从事植物逆境生理研究。E-mail：hhwang04@163.com。

铝是地壳中含量最丰富的金属元素。通常情况下，铝以不溶性硅酸盐或氧化物的形式存在。当土壤发生酸化（pH值<5）时，铝会以有毒Al3+的状态释放进土壤溶液中，对植物产生毒害[1]。铝毒最明显的特征是抑制植物根尖生长，影响植物对水分及营养物质的吸收，从而导致植物生长受到抑制及农作物减产。然而，目前关于铝对根生长的抑制机制还不太清楚。

正常情况下，生物体内活性氧的生成和清除处于动态平衡，当活性氧浓度超过正常水平时，即对细胞构成氧化胁迫。铝毒可引起植物体内活性氧的过量积累，从而导致植物细胞遭受氧化伤害。为了减轻和防止活性氧损伤，植物体形成了相应的氧化应激机制。目前研究得比较清楚的是细胞可通过抗氧化酶，如过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等清除过量的活性氧并抑制脂质过氧化，从而避免细胞遭受氧化伤害[2]。

一氧化氮（NO）作为一种重要的信号分子，参与植物生长发育和胁迫反应的调节[3]。研究表明，NO在种子萌发、根伸长、植物衰老、程序性细胞死亡和气孔运动中发挥着重要的作用[4]。此外，NO也可在非生物胁迫中对植物发挥保护作用，且该作用与NO介导的活性氧含量减少密切相关[5-6]。然而，关于NO在铝胁迫诱导的大豆根生长抑制中的调节作用及其机制还不太清楚。本研究通过NO供体硝普钠（SNP）处理大豆幼苗，探讨铝胁迫下外源NO对铝毒的调节作用，以期为进一步揭示大豆抗铝毒信号网络途径及筛选和培育抗铝毒品种提供帮助。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试大豆种子由甘肃省农业科学院提供。

1.2 材料培养

选取大小一致的大豆种子，用清水浸泡后均匀放置在充分吸水的海绵上，并在种子表面覆盖1层湿润的纱布，置于28 ℃恒温培养箱中黑暗培养48 h，然后挑选根长约2 cm的大豆種子，置于1/4霍格兰氏培养液中培养3 d，培养条件为温度25 ℃，光照度150 μmol/（m2·s），相对湿度70%，光—暗周期14 h—10 h。

1.3 材料处理

采用AlCl3模拟铝胁迫处理，以硝普钠（SNP）为外源NO供体，将生长3 d的大豆幼苗分别移入400 mL含有0（对照） μmol/L、50（50AI） μmol/L、100（100AI） μmol/L AlCl3或25 μmol/L SNP（SNP）、25 μmol/L SNP+50 μmol/L AlCl3（50Al+SNP）、25 μmol/L SNP+100 μmol/L AlCl3（100Al+SNP）的CaCl2溶液（0.5 mmol/L，pH值为4.5）中处理24 h。处理后收集主根用于各项指标的测定。

1.4 测定方法

根伸长量的测定：选取生长3 d、长势相似的大豆幼苗，测量其处理前根长，处理后再次对根长进行测量，根伸长量为2次根长的差值;根伸长区细胞的观察：取长约2 cm的大豆根尖，用蒸馏水冲洗后，置于卡诺氏固定液中在4 ℃下固定24 h，将固定好的根尖置于1 mol/L盐酸溶液中解离10～15 min，用蒸馏水冲洗后压片观察;根尖丙二醛（MDA）、H2O2含量的测定参照Liu等的方法[7];POD、CAT、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定参照Wang等的方法[8]。所测指标均至少重复3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 铝胁迫对大豆根伸长和伸长区细胞伸长的影响

根伸长的受抑制程度是反映植物受铝毒害程度的重要指标。为了检测大豆对铝胁迫的敏感性，本研究检测不同铝浓度对根生长的影响，结果（图1）发现，随着AlCl3浓度的升高，大豆根伸长量逐渐降低。具体表现为与对照相比，50、100 μmol/L AlCl3处理的根伸长量分别降低24%、39%，且铝胁迫不仅对大豆主根的生长造成了抑制，也影响了侧根的生长和数量。

为了进一步探究铝胁迫对大豆幼苗根生长抑制的机制，对根尖伸长区细胞的伸长量进行检测。由图2可知，铝胁迫下根尖伸长区细胞的伸长量与根伸长量呈正相关关系，表现出与根伸长一致的变化趋势。具体表现为50、100 μmol/L AlCl3处理的根尖伸长区细胞伸长量与对照相比分别减少18%、33%。说明铝胁迫可能通过抑制根尖伸长区细胞的伸长来抑制大豆根的生长。

2.2 鋁胁迫下NO对大豆根伸长和伸长区细胞伸长的影响

由图3可知，单独SNP处理对大豆幼苗根伸长量无明显影响;而50、100 μmol/L AlCl3胁迫下，SNP处理显著缓解了根的伸长抑制，根伸长量比单独铝处理时分别增加18.6%、33.1%。

根尖伸长区是植物感受铝毒害的主要区域。为了探究铝胁迫下NO缓解根生长抑制的原因，本研究测定了铝胁迫下NO处理后根尖伸长区细胞伸长量的变化。由图3可知，铝胁迫下SNP处理显著缓解了根尖伸长区细胞的伸长抑制。具体表现为SNP+50 μmol/L AlCl3和SNP+100 μmol/L AlCl3处理分别比单独铝处理时细胞伸长量增加15.3%和19.2%。表明铝胁迫下NO可通过缓解根尖伸长区细胞伸长抑制来缓解铝毒害对根的生长抑制。

2.3 铝胁迫下NO对根尖MDA、H2O2含量的影响

丙二醛、活性氧含量是衡量植物遭受氧化伤害程度的重要指标[9]。为了探究铝胁迫导致的根生长抑制是否由氧化伤害造成，本研究检测根尖MDA、H2O2含量。由图4可知，与对照相比，50 μmol/L AlCl3处理的根尖MDA、H2O2含量分别增加29.8%、40.1%;添加SNP后，MDA、H2O2含量与单独铝处理相比分别降低47.6%、32.3%。随着铝处理浓度的升高，MDA、H2O2含量也逐渐升高，但SNP依然可以显著降低根尖MDA、H2O2含量。说明SNP可通过缓解根尖细胞受氧化伤害的程度，改善大豆根的生长抑制情况。

2.4 铝胁迫下NO对抗氧化酶活性的影响

过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化氢酶是植物体内重要的抗氧化酶，它们能够清除多余的活性氧，维持植物体内活性氧平衡，保护植物免受氧化伤害。为了进一步探究NO增强根尖细胞抗氧化能力的原因，本研究检测抗氧化酶活性的变化。由图5可知，与对照相比，铝胁迫处理显著增强了CAT、APX、POD的活性，SNP处理则进一步提高了这3种酶的活性。例如，50 μmol/L AlCl3胁迫下，添加SNP处理后，CAT、APX、POD的活性与单独铝处理相比分别增加了31.3%、39.5%、38.7%。说明NO可能通过提高CAT、APX、POD的活性来清除多余的活性氧，从而避免或降低根尖细胞受到的氧化伤害。

3 讨论与结论

铝会在植物根尖中积累，与细胞膜中磷脂结合可以导致膜的僵化，从而抑制根系的生长，导致植物生长受限和农作物减产。根伸长抑制是植物遭受铝毒害时最初和最明显的症状之一[10]。本研究结果显示，铝处理后，大豆根生长和根尖伸长区细胞的伸长受到了明显的抑制，且两者呈现出正相关性，表明铝胁迫诱导的根生长抑制可能是由于根尖伸长区细胞的伸长受到抑制所导致的。

有研究表明，NO参与了植物受铝胁迫时的生理反应过程，例如减轻铝诱导的决明子幼苗根系生长抑制[1]。然而，尚不清楚NO调节铝诱导的植物根生长抑制的机制。本研究探讨铝胁迫下NO的作用效果，结果表明，铝胁迫下NO显著缓解了大豆根的伸长抑制，且NO主要是通过缓解根尖伸长区细胞的伸长抑制来缓解根生长抑制。

植物在遭受铝毒害后通常会出现氧化应激和膜脂过氧化等相关症状[11]。有研究报道表明，铝诱导的毒害与植物中H2O2含量的增加有关[12]。H2O2在根中的积累可能最终导致根伸长量的降低[13]。本研究结果表明，铝胁迫显著增加了大豆根尖中MDA、H2O2含量，其诱发的活性氧积累可能是大豆幼苗在遭受铝胁迫时根生长受到抑制的原因。NO供体处理降低了大豆根中铝诱导的H2O2产生量和膜脂过氧化程度，这可能是缓解大豆根伸长受到抑制的原因。

CAT、APX、POD是植物体内抗氧化系统关键酶，它们可以通过清除细胞中多余的活性氧来缓解铝毒害[14]。本研究中，铝处理后大豆根尖CAT、APX、POD的活性与对照相比显著增强，添加NO处理后，这3种酶活性进一步增强，表明NO缓解铝诱导的氧化伤害可能是通过调控体内抗氧化酶活性清除多余的活性氧来完成的。

综上所述，本研究发现，铝胁迫通过诱导大豆根尖活性氧的积累，导致根尖膜脂过氧化，使得根尖伸长区细胞的伸长受到抑制，从而导致大豆根生长受到抑制。NO通过增强大豆幼苗抗氧化酶活性，清除多余的活性氧积累，减轻铝诱导的氧化胁迫，缓解大豆根生长抑制。

参考文献：

[1]Wang Y S，Yang Z M. Nitric oxide reduces aluminum toxicity by preventing oxidative stress in the roots of Cassia tora L.[J]. Plant and Cell Physiology，2005，46（12）：1915-1923.

[2]Mittler R. Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance[J]. Trends in Plant Science，2002，7（9）：405-410.

[3]Gupta K J，Fernie A R，Kaiser W M. On the origins of nitric oxide[J]. Trends in Plant Science，2011，16（3）：160-168.

[4]Shi H T，Wang Y P，Cheng Z M，et al. Analysis of natural variation in bermudagrass （Cynodon dactylon） reveals physiological responses underlying drought tolerance[J]. PLoS One，2012，7（12）：e53422.