郭晓梅 郭雷

山东鲁抗舍里乐药业有限公司 山东济宁 272100

恩拉霉素（Enramycin）是由包括13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子组成的多肽类抗生素，包含恩拉霉素A和恩拉霉素B两种成分，其对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用，它有利于饲料营养成份的消化吸收，提高饲料利用率，是一种全新的动物专用抗生素促生长剂[1]。

目前，微生物学效价方法测定恩拉霉素含量较为普遍，在《进口兽药质量标准》中，也是采用的微生物学方法，该方法操作复杂且有一定缺点，而高效液相色谱法由于其快速、准确、操作方便的优点，应用较为广泛。将HPLC法应用到对恩拉霉素的检测中，必然会给生产与研发带来便捷。而HPLC法测定恩拉霉素含量的文献鲜见报道。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

戴安U-3000高效液相色谱仪和UV检测器；梅特勒AB104-N型电子天平；FE20型酸度计。

恩拉霉素标准品（含量为968u/mg）、恩拉霉素发酵液、恩拉霉素预混剂均有鲁抗舍里乐药业有限公司提供；

甲醇浸提液：甲醇：2M盐酸：水=20：1：21（V/V/V）

1.2 色谱条件

岛津WondaSil C18（200×4.6mm，5μm，）为测定色谱柱，乙腈：50mM磷酸二氢钠 3：7（V/V，pH 4.5±0.1）为流动相，267nm的波长，1.0ml/min的流速，柱温选择室温，进样20μL，运行20min。

1.3 工作标准溶液的制备

取恩拉霉素标准品50mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用甲醇浸提液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准储备液。分别精密量取该液2、4、6、8、10ml置于10ml量瓶中，用甲醇浸提液定容至刻度，摇匀，作为工作标准品溶液，恩拉霉素含量分别为200、400、600、800、1000（ mg/ml）。

1.4 样品溶液的制备

发酵液样品处理：取发酵液2ml于一试管中，加18ml甲醇浸提液，摇匀后超声30分钟，离心后取上清液过0.45um滤膜（尼龙66）过滤，即得。

4%预混剂样品处理：精密称取1.00g 4%预混剂（或闪蒸粉）于 250ml三角瓶中，加入100ml甲醇浸提液，摇匀后超声半小时，离心10分钟，上清液用0.45μm滤膜过滤，即得。

2 结果与讨论

2.1 线性关系考察

分别将制备好的工作标准品溶液用HPLC测定，以恩拉霉素浓度x（mg/ml）为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=1695.4x+18095，相关系数R2=0.999。结果表明恩拉霉素在浓度200-1000mg/ml范围内线性关系良好[2]。

2.2 精密度试验

在选定的色谱条件下，用恩拉霉素标准品溶液重复进样5次，峰面积分别为 1702661、1704500、1704890、1704279、1707223，RSD为0.10%，由数据可知其精密度较好。

2.3 稳定性考察

将供试品溶液放置12小时，测定初始值后，每隔两个小时测定一次，对应峰面积分别为1679528、1679282、1677904、1675449、1677717、1676122、1681359，

RSD为0.10%，说明在12小时内溶液比较稳定。

2.4 加标回收率试验

精密吸取已知含量的供试品溶液，分别加入一定量的恩拉霉素标准品溶液，用HPLC测定，回收率为99.42%，RSD为2.08%，回收率良好。

2.5 耐用性试验

（1）改变柱温：分别改变柱温为 24.5℃、25.0℃、25.5℃，进样后记录主峰峰面积和保留时间，并计算3针峰面积，分别为1755334、1725755、1725514，RSD 为 0.99%， 表 明 在 24.5-25.5℃适用该操作。

（2）改变色谱柱批号：选择相同品牌，不同序列号（9E9601-03、2A9601-06、2A9601-09）的色谱柱进行验证，结果表明峰面积RSD为0.41%。

（3）改变流速：按照±10%的变量选择0.9和1.1mL/min，进样后记录主峰峰面积和保留时间，峰面积RSD为0.02%，表明流速在0.9-1.1ml/min范围适用该操作。

2.6 样品的含量测定

取恩拉霉素发酵液、恩拉霉素预混剂各3批样品，按上述方法制备供试品溶液，用高效液相色谱仪检测，记录峰面积，按外标法计算预混剂含量，1602003批次为4.02%，1603001批次为3.98%，1603002为4.05%，说明批预混剂含量差异较小，样品含量测定方法比较稳定[3]。

3 结语

采用高效液相色谱法检测恩拉霉素发酵液及预混剂中恩拉霉素的含量，实验所得线性方程为：y=1695.4x+18095，相关系数R2=0.999，线性关系较好，该方法的回收率都95%-105%之间，符合分析要求。通过实验可知，我们选定的方法操作简便、准确度高、耐用性好等优点，能有效的检测发酵液、预混剂中恩拉霉素的含量。