李刚，刘江豪，牛青青

(新疆维吾尔自治区生殖健康医院，乌鲁木齐830000)

胆固醇结石病(胆石病)是常见的消化系统疾病，随着生活水平的提高、人口老龄化和健康检查的普及，其发病率和检出率逐年上升[1，2]。胆石病的发病机制尚未完全阐明，目前认为胆石病是肝脏脂质代谢异常的结果，如脂质和胆汁盐不平衡、胆固醇过饱和等；此外，胆囊功能异常与胆石病的发生发展也有密切关系，如胆囊排空异常、浓缩增强、脂质吸收紊乱等[3～5]。Rho GTP酶属于Ras超家族，RhoA和RhoB是Rho GTP酶的重要成员；ROCK又称Rho激酶，是Rho的下游信号分子。研究表明，在胆囊平滑肌细胞中，Rho-ROCK信号通路能够通过调节钙调信号通路影响胆囊平滑肌的收缩功能[6]。Ca2+依赖性肌球蛋白轻链激酶(MLCK)与Ca2+非依赖性肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)双重调节肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化水平，前者对MLC磷酸化的调节导致平滑肌收缩，而后者抑制平滑肌收缩并增加Ca2+敏感性。胆囊平滑肌收缩异常能够引起胆囊功能异常，与胆石病的发生密切相关。目前关于Rho-ROCK信号和钙调信号通路与胆石病关系的研究较少。2018年3月～2019年5月，我们采用高胆固醇饮食诱导制作胆石病小鼠模型，观察小鼠胆囊组织中Rho-ROCK信号相关分子RhoA、RhoB、ROCK和钙调信号相关分子MLCK、p-MLC、MLCP的表达，探讨Rho-ROCK信号和钙调信号相关分子在胆固醇结石形成过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 雄性C57BL/6小鼠40只，体质量20～22 g，购自新疆医科大学动物实验中心，正常饮食适应性喂养1周后用于实验。MLCK、p-MLC、MLCP、RhoA、RhoB、ROCK、GAPDH抗体(Abcam，英国)；蛋白裂解液(碧云天，中国)；羊抗兔IgG-HRP抗体、羊抗鼠IgG-HRP抗体(武汉博士德生物工程有限公司，中国)；超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天，中国)；牛血清白蛋白(BSA，北京索莱宝科技有限公司，中国)；戊巴比妥钠(Sigma，美国)；Fluo-3 AM(碧云天，中国)；96孔板(康宁，美国)；荧光酶标仪(赛默飞，美国)；HITACHI自动分析仪7600(Tokyo，日本)；TRIzol裂解液及RT-PCR逆转录和定量试剂盒(诺唯赞，中国)；NanoDrop 2000 Spectrophotometer(赛默飞，美国)；BCA蛋白定量试剂盒(碧云天，中国)；PVDF膜(Millipore，美国)。本实验通过动物伦理委员会审核批准。

1.2 动物分组与模型制作 将小鼠随机分为对照组和胆石组各20只，对照组给予正常饮食，胆石组给予高脂饮食(1.0%胆固醇、0.5%脂肪酸和20%脂肪)，饮水不限，喂养8周。以小鼠胆囊出现胆泥或结石为造模成功。

1.3 胆囊结石形成情况观察 腹腔注射戊巴比妥钠35 mg/kg麻醉小鼠，腹部切口，暴露胆囊、胆总管，观察胆囊有无结石形成以及结石形态。

1.4 胆汁分泌率测算 胆总管插管，另一端接1.5 mL EP管，利用重力作用收集1 h胆汁，计算胆汁分泌率，胆汁分泌率=胆汁体积/(胆汁质量×时间)。

1.5 胆汁钙离子检测 用去离子水稀释胆汁，加入96孔板，然后加入Fluo-3 AM(Ca2+荧光探针)，37 ℃孵育60 min，将96孔板置于荧光酶标仪(激发波长488 nm，发射波长530 nm)检测荧光值。

1.6 血清和胆汁胆固醇检测 眼球取血1.5 mL，3 000 r/min离心5 min，取上清。取“1.4”收集的胆汁，加入去离子水稀释胆汁和血清，使用HITACHI自动分析仪检测总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。非HDL-C=总胆固醇-HDL-C。

1.7 胆囊病理组织学检查 小鼠脱颈椎处死，取出胆囊，切取约30 mg，置于4%多聚甲醛固定，剩余胆囊组织放入液氮保存。梯度乙醇脱水，蜡块包埋，切5 μm厚切片。将玻片脱蜡，行HE染色，显微镜下观察胆囊组织病理变化。

1.8 胆囊组织Rho-ROCK信号和钙调信号相关分子mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取冻存的胆囊组织，称取约50 mg，加入1 mL TRIzol裂解液提取组织总RNA，逆转录合成cDNA。使用配有SYBRs Green Master Mix的CFX ConnectTMReal-Time系统进行qRT-PCR定量分析。RT-PCR引物序列：MLCK上游5′-CAACAGTGGCAATGGAGC-3′，下游5′-GATTCGCAATGAAACAATCA-3′；p-MLC上游5′-ACCTGCGTAACTCCAATCT-3′，下游5′-TTGTCCGACCAGTTCTTC-3′；RhoA上游5′-CCAAATGTGCCCATCATCCTAGTTG-3′，下游5′-TCCGTCTTTGGTCTTTGCTGAACAC-3′；ROCK上游5′-AGGCCTGTGCCAAACCTTT-3′，下游5′-TGGTCCCTGTGGGACTTAACA-3′；RhoB上游5′-ATATTAGCGTGGGCACCGAG-3′，下游5′-GTAGGGGTGTAGGGAGTCGT-3′；GAPDH上游5′-TTCTACAATGAGCTGCGTCT-3′，下游5′-CTCATAGCTCTTCTCVAGGG-3′。扩增体系：2×SYBRs Green Master Mix，10 μL；引物(10μmol/L)，0.8 μL；50×ROX Reference Dye 1，0.4 μL；cDNA，8.8 μL。扩增条件：预变性94 ℃，5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.9 胆囊组织Rho-ROCK信号和钙调信号相关分子蛋白表达检测 采用Western blotting法。取胆囊组织约50 mg，加入1 mL蛋白裂解液提取组织总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。取20～50 μg总蛋白，经10%的SDS-PAGE胶电泳，电转移至PVDF膜，用5%的BSA封闭60 min。TBST洗涤，加入一抗(MLCK、p-MLC、MLCP、RhoA、RhoB、ROCK、GAPDH，以1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜。TBST洗涤加入HRP标记山羊抗兔二抗(以1∶10 000稀释)，室温孵育，TBST洗涤。用ECL化学发光法显影，Image J软件分析灰度值。以目的蛋白与GAPDH的比值计算目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 两组胆囊结石发生情况、胆汁分泌率及Ca2+水平比较 对照组胆囊无结石和胆泥形成，胆石组胆囊出现胆结石6只、胆泥5只，其余9只未造模成功被排除。胆石组胆汁分泌率及Ca2+水平均低于对照组(P均<0.05)。见表1。

表1 两组胆汁分泌率及Ca2+水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 两组血清和胆汁胆固醇水平比较 与对照组相比，胆石组血清和胆汁总胆固醇、非HDL-C水平均升高(P均<0.05)，两组HDL-C水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组血清和胆汁胆固醇水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3 两组胆囊组织病理学结果比较 对照组胆囊壁无增生，基质层中炎症细胞浸润较少；胆石组胆囊壁增厚，基质层中性粒细胞浸润，具有明显炎症迹象。

2.4 两组胆囊组织钙调信号相关分子mRNA及蛋白表达比较 与对照组比较，胆石组胆囊组织MLCK、p-MLC mRNA及蛋白表达下调，MLCP mRNA及蛋白表达上调(P均<0.05)。见表3。

表3 两组胆囊组织钙调信号相关分子mRNA及蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.5 两组胆囊组织中Rho-ROCK信号相关分子mRNA及蛋白表达比较 与对照组相比，胆石组胆囊组织RhoA、RhoB、ROCK mRNA及蛋白表达均下调(P均<0.05)。见表4。

表4 两组胆囊组织Rho-ROCK信号相关分子mRNA及蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

研究显示，胆石病的发生与脂代谢异常、胆囊功能异常、胆固醇过饱和等多种因素相关，但其具体机制目前仍未阐明。Rho-ROCK信号和钙调信号在糖尿病肾病、神经性疾病、肿瘤及心脏病等重大疾病的发生过程中发挥重要作用，作为疾病治疗靶点广受关注[6]，但是其在胆石病发生中的研究较少。本研究通过高脂饮食诱导制作小鼠胆石病模型，表现为胆结石的发生率、胆汁和血清中的总胆固醇和非HDL-C含量显著上调，上述这种变化很好地模拟了胆石病患者的相关脂质变化。

胆固醇结石的形成并不完全依赖于胆囊生理和化学环境的改变，胆囊功能特别是其收缩功能障碍在胆结石的形成过程中起关键作用[7，8]。胆囊中晶体的形成能够显著抑制胆囊排空，影响胆汁分泌[9，10]。Ca2+在胆囊平滑肌收缩过程中起重要作用，其能够通过调节胆囊收缩影响胆囊排空和胆汁分泌[11]。本研究显示，胆石组胆汁分泌率下降，胆汁中Ca2+含量下降，表明Ca2+含量降低可能通过钙调信号通路影响胆囊平滑肌收缩，引起胆囊功能异常，最终导致胆石病的发生。

MLC磷酸化水平受到MLCK和MLCP的双重调节，其在平滑肌收缩过程中起关键作用[12]。Ca2+含量升高时，MLCK使MLC磷酸化导致平滑肌收缩，而MLCP使MLC去磷酸化，抑制平滑肌收缩[13]。本研究结果显示，长期给予高脂饮食能够显著下调胆汁中的Ca2+浓度，胆囊组织中MLCK和p-MLC蛋白及mRNA表达下调，MLCP蛋白和mRNA表达上调。在平滑肌细胞中MLCP上调能够抑制Ca2+的敏感性，并促进MLC的磷酸化水平，导致平滑肌收缩抑制[14]。以上研究表明，MLC在胆囊的收缩过程中起着关键作用。

研究显示，Rho-ROCK信号通路能够通过调节MLC的磷酸化和去磷酸化水平来调节平滑肌的收缩过程[15]。当ROCK表达抑制或下调时，MLC表达将会下调且MLCP的活性增强，ROCK可能通过抑制MLCP的活性来调节平滑肌的收缩[16]。本研究结果显示，长期给予高脂饮食能够显著下调胆囊中的RhoA、RhoB、ROCK的蛋白和mRNA表达，表明Rho-ROCK信号通路在胆石病的发生发展过程中具有重要作用。

综上所述，高脂饮食可致胆汁中Ca2+水平下降、胆汁和血清中总胆固醇和非HDL-C含量升高，诱导胆固醇结石形成。高脂饮食诱导结石形成过程中胆囊组织出现炎症迹象及Rho-ROCK和钙调信号相关分子表达出现变化，提示Rho-ROCK和钙调信号相关分子可能参与高脂饮食诱导胆固醇结石的形成过程。本研究为胆石病相关治疗药物的开发提供了一定的线索。