李静，韩清云，陆军，3，穆敏，赵月侠，邵坤

(1阜阳市妇女儿童医院，安徽阜阳236001；2安徽理工大学医学院；3安徽理工大学第一附属医院；4阜阳市第二人民医院)

冠心病主要发生在中老年群体，且男性发病时间早于女性。流行病学调查显示，冠心病的发生是受多种因素影响与作用的结果，目前普遍认为，其发生主要受遗传因素和环境因素的影响[1]。ELOVL脂肪酸延长酶2(ELOVL2)基因能够编码长链脂肪酸延长酶，是多不饱和脂肪酸(FUFAs)代谢通路上重要的限速酶，其活性可以直接对FUFAs的合成产生影响[2]。国外的相关研究显示，ELOVL基因的单核苷酸多态性(SNP)和人体不同组织中的脂肪酸组成谱有关联性[3～5]，即携带不同基因型的人体其脂肪酸的组成有显著差异，在国内其相关研究较少。本研究探讨了安徽地区汉族人群ELOVL2基因SNP位点rs2236212与冠心病易感性之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年8～12月安徽理工大学第一附属医院收治的冠心病患者230例(病例组)，男117例、女113例，年龄(58.3±14.7)岁。选取同期健康体检者330例(对照组)，男178例、女152例，年龄(57.6±13.9)岁。两组性别、年龄具有可比性，所有研究对象之间均没有血缘关系，且为安徽地区汉族人。本研究经安徽理工大学第一附属医院医学伦理委员会审核批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 ELOVL2基因rs2236212多态性检测 采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法。采集受试者外周静脉血2 mL，置入含EDTA的真空抗凝管内，-80 ℃保存备用。采用全式金血液基因组DNA提取试剂盒提取血液DNA，严格按照说明书进行操作。PCR扩增引物设计通过NCBI数据库https://www.ncbi.nim.nih.gov/pubmed/查找ELOVL2基因的SNP位点rs2236212的序列，使用https://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/网站对选取的SNP位点进行PCR扩增引物设计。上游引物为5′-ATGGGACATATGATGTGTGGAA-3′，下游引物为5′-AGACCACTGGTGCTGTCTTGTA-3′，产物长度204 bp。PCR反应体系(20 μL)：模板DNA 1 μL，2×PCR master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。取PCR产物5 μL进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司，采用Sanger测序技术检测并分型。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，计数资料采用χ2检验。等位基因频率=(该基因纯合子个体数×2+该基因杂合子数)/总个体数×2；基因型频率=人群中某基因型个体数/该人群的总个体数×100%。以GG表示野生基因型、CC表示突变基因型、CG表示杂合基因型，分为暴露组CC+CG、CC、CC+GG，非暴露组GG、GG+CG、CG，构建4种常见的遗传模型，即显性模型(CC+CGvsGG)、隐性模型(GG+CGvsCC)、纯合子模型(CCvsGG)、超显性模型(CC+GGvsCG)，观察冠心病患者的基因型分布情况。采用Logistic回归分析冠心病发生的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果 对照组SNP位点基因型频率分布符合Hardy-Weinberg检验分析(P>0.05)，说明选取的样本符合遗传平衡，具有很好的人群代表性。

2.2 两组ELOVL2基因rs2236212多态性分型 PCR-RFLP扩增结果见图1。对扩增的目的基因片段进行Sanger测序，结果为野生型GG、突变型CC、杂合型GC。见图2。

2.3 ELOVL2基因rs2236212多态性与冠心病的相关性

图1 ELOVL2基因rs2236212的PCR扩增产物电泳图

注：反向引物测序结果为GG、CC、GC基因型，正向读取结果为CC、GG、CG基因型。

图2 ELOVL2基因rs2236212多态性的Sanger测序结果

2.3.1 基因型和等位基因分布情况 两组基因型频率分布比较差异有统计学意义(P<0.05)，两组等位基因频率分布比较无统计学差异(P>0.05)，见表1。男性与女性在两组的基因型和等位基因频率分布比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表2。

表1 两组rs2236212位点基因型和等位基因分布比较(%)

表2 男性与女性rs2236212位点基因型和等位基因分布比较(%)

注：两组相同性别间比较，P均>0.05。

2.3.2 两组在不同遗传模型中的基因型分布比较 两组在隐性模型、超显性模型中的基因型分布具有统计学意义(P均<0.01)，见表3。在隐形模型中，病例组GG+CG基因型频率高于对照组，CC基因型频率低于对照组(P=0.009)；Logistic回归分析显示，GG+CG基因型与CC基因型相比是冠心病发生的危险因素(OR=1.593，95%CI为1.125～2.256)。在超显性模型中，病例组CC+GG基因型频率低于对照组，CG基因型频率高于对照组(P=0.005)；Logistic回归分析显示，CG基因型与CC+GG基因型相比是冠心病发生的危险因素(OR=1.618，95%CI为1.153～2.272)。

表3 两组不同遗传模型分析结果(%)

2.3.3 男性及女性在不同遗传模型中的基因型分布比较 进一步按照性别进行分层，男性在隐性模型、超显性模型中的基因型分布具有统计学意义(P均<0.05)。见表4、5。在男性隐形模型中，病例组GG+CG基因型频率高于对照组，CC基因型频率低于对照组(P=0.039)；Logistic回归分析显示，GG+CG基因型与CC基因型相比是冠心病发生的危险因素(OR=1.676，95%CI为1.025～2.743)。在男性超显性模型中，病例组CC+GG基因型频率低于对照组，CG基因型频率高于对照组(P=0.038)；Logistic回归分析显示，CG基因型与CC+GG基因型相比是冠心病发生的危险因素(OR=1.645，95%CI为1.027～2.637)。女性在四种遗传模型中的基因型分布均无统计学意义(P均>0.05)。

3 讨论

ELOVL2基因位于染色体6p24.2区域，分别由7个内含子和8个外显子组成，基因组全长36 kb，可编码296个氨基酸。ELOVL2基因是ELOVL基因家族中的一员，可以编码长链脂肪酸延长酶，是PUFAs代谢通路上重要的限速酶，能够把饱和、单不饱和脂肪酸延长为PUFAs的酶，PUFAs的合成直接受其活性影响。PUFAs是指含有两个或者更多不饱和双键结构的脂肪酸，根据第一个不饱和键位置的不同，FUFAs可以分为ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列。膳食脂肪酸与血脂代谢、冠心病以及动脉粥样硬化等发生相关。早在上世纪80年代就有研究发现，鱼油中的ω-3 FUFAs具有抗炎、抗血栓形成的作用，还可以预防和减少动脉样硬化形成[6]。

表4 不同遗传模型在男性中的分析结果(%)

表5 不同遗传模型在女性中的分析结果(%)

ELOVL基因簇参与脂肪酸碳链的延长过程，可以形成更多复杂的长链PUFAs，如二十二碳六烯酸(DHA)[7，8]。Lemaitre等[5]研究了5个欧洲队列人群共8 866人的全基因组关联结果显示，ELOVL2基因多态性与血浆4种主要ω-3系列的FUFAs[包括α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)及DHA]水平有相关性，rs2236212次等位基因携带者的DHA水平显著降低。Alsaleh等[9]探讨了ELOVL2基因多态性与鱼油补充后血浆EPA、DHA比例是否增加，选取rs3734398、rs2236212、rs953413位点，对310例受试者进行基因分型，发现所有次要等位基因的携带者比非携带者血浆中含有更低的DHA比例，在给予1.8 g/d EPA、DHA服用后，发现次要等位基因的携带者比非携带者具有高约30%的EPA比例和高9%的DHA，因此较小的等位基因携带者可以受益于大量摄入EPA和DHA以维持高水平的血浆ω-3 PUFAs，这有助于防止冠心病的发生。

本研究分析了安徽地区汉族人群ELOVL2基因rs2236212多态性与冠心病易感性的相关性，发现突变型CC与杂合型CG相比是冠心病发生的危险因素；在构建的四种遗传模型中，其隐性模型中GG和CG基因型与CC基因型相比可能是冠心病发生的危险因素，在超显性模型中，CG基因型与CC和GG基因型相比可能是冠心病发生的危险因素。在男性模型中，其隐性模型与超显性模型中也得到了相同的结果，在女性遗传模型中未发现相同结果，这可能与受试者性别、人数以及受试者所携带基因型的差异有关。在我国，冠心病的发病因素在性别上存在差异，除遗传因素外，女性的患病危险因素主要与糖尿病、高血压、高龄及血脂异常等有关，男性主要与吸烟、血脂代谢紊乱等有关[10]。本研究发现男性较女性易感性更加显著，可能所研究对象吸烟者中男性人数比女性多等有关联，或者与研究性别人数差异相关。目前在国内未发现ELOVL2基因rs2236212多态位点与冠心病易感性的相关报道。

综上所述，ELOVL2基因rs2236212多态位点与安徽地区汉族人群冠心病的发病可能有相关性，其突变型CC可能增加冠心病的发生风险。下一步我们将针对遗传学引起的差异导致体内EPA、DHA血浆浓度差异进行研究。