杨亮，许文婷，赵倩，吴涛，迪力夏提·金汗，李丹，杜露，王波，朱丽萍

(新疆医科大学第三临床医学院附属肿瘤医院，乌鲁木齐830011)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，乳腺癌转移及复发是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。目前对乳腺癌的分子生物学机制已有很多研究，但是仍然缺乏针对乳腺癌转移和复发有效控制的方法。寻找乳腺癌患者复发、转移的关键基因和蛋白，对指导个体化治疗、提高患者的生存率具有重要意义。腋窝腋淋巴结是否转移是制定乳腺癌治疗方案的重要参考依据，也是乳腺癌重要的独立预后影响因子[1]。乳腺浸润性导管癌约占乳腺癌的70%，部分类型恶性程度较高。本研究采用蛋白质组学技术分析腋窝淋巴结转移和未转移乳腺浸润性导管癌患者癌组织中的差异表达蛋白，寻找可能在乳腺癌淋巴结转移过程中起关键作用的蛋白，为筛选新的治疗靶点提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1月～2018年1月我院收治的原发乳腺浸润性导管癌患者12例，均为女性，年龄25～48岁，其中腋窝淋巴结转移7例、腋窝淋巴结未转移5例。纳入标准：经病理检查确诊为乳腺浸润性导管癌；入院前未行放疗、化疗、手术、生物靶向及内分泌等治疗；KPS≥80分，能够接受乳腺癌改良根治术治疗；无其他脏器系统恶性肿瘤病史。排除标准：导管原位癌及小叶原位癌、乳腺浸润性小叶癌；入院后B超检查提示为多灶性乳腺癌；乳腺转移肿瘤及其他特殊类型乳腺肿瘤(如家族性乳腺癌、遗传性乳腺癌、乳腺肉瘤、男性乳腺癌、炎性乳腺癌、妊娠期乳腺癌、乳腺淋巴瘤、微乳头状癌等)。术中留取乳腺癌组织、距癌组织病灶≥3 cm的癌旁组织和正常乳腺组织(距离癌旁病灶≥5 cm)，加入液氮中速冻，-80 ℃保存，用于差异蛋白的筛选。另取我院病理科保存的2016～2018年乳腺浸润性导管癌组织164例，用于差异表达蛋白的免疫组化验证。患者年龄28～72(46.71±11.28)岁，其中腋窝淋巴结转移66例、腋窝淋巴结未转移98例，转移和无转移患者的年龄、TNM分期、是否绝经差异无统计学意义(P均>0.05)，肿块大小、分子分型差异有统计学意义(P均<0.01)。见表1。本研究经医院伦理委员会审核批准，患者均签署知情同意书。

表1 腋窝淋巴结转移与无转移的乳腺浸润性导管癌患者临床病理资料比较(例)

1.2 差异表达蛋白的筛选

1.2.1 样品制备与总蛋白提取 取12例乳腺癌组织、癌旁组织和正常乳腺组织标本，清洗后剪碎，加入液氮研磨成粉末。放入EP管中，加入裂解液，离心取上清液。采用BCA法进行总蛋白定量分析，分装于EP管中，-80 ℃保存。

1.2.2 组织蛋白的分离 取50 μg蛋白样品与水化液混合，准备蛋白质分子量参照标准物。二维凝胶电泳上样，等电聚焦结束后，将IPG胶条置于平衡缓冲液中均衡，再将胶条转入垂直电泳槽中，进行第二向电泳，然后用硝酸银染色，分析电泳后蛋白位点。每种组织蛋白样品重复3个胶板。将图像分析得到的蛋白差异位点从凝胶上切除，冲洗，脱色，脱水，进行酶解反应后进行质谱分析。

1.2.3 差异表达蛋白位点的定量分析 采用Image Master 2D-Platinum 5.0图像分析软件对乳腺癌组织和癌旁组织差异表达的蛋白位点进行对比、定量分析。以癌旁组织和正常乳腺组织标本做对照，排除个体差异的影响，筛选标记蛋白位点。分析蛋白位点的差异倍数，两组蛋白表达量的差异倍数>2.0或<0.5且具有重复性时认为是差异蛋白位点。

1.2.4 差异表达蛋白的鉴定 采用二维凝胶电泳结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MELDI-TOF-MS)对筛选出来的差异蛋白位点进行质谱鉴定，通过检索数据库确定蛋白名称及功能。

1.3 差异表达蛋白的验证 应用免疫组化SP法检测164例乳腺浸润性导管癌组织中差异蛋白的表达。由3位病理专家采用双盲法对免疫组化结果进行评分：①对阳性细胞占总细胞的比例进行评分，无为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，81%～100%为4分。②对阳性细胞染色强度进行评分，阴性为0分，弱阳性为1分，中度阳性为2分，强阳性为3分。将上述两项评分相加，总分0～3分为阴性，4～7分为阳性。

2 结果

2.1 乳腺癌、癌旁组织和正常乳腺组织的二维电泳图谱分析结果 正常乳腺组织二维电泳图谱可辨识约3 500个蛋白位点，乳腺癌组织得到(3 689±64)个蛋白位点，癌旁组织得到(3 562±89)个蛋白位点。腋窝淋巴结转移及未转移乳腺浸润性导管癌组织得到(3 781±78)、(3 475±86)个蛋白位点。

2.2 腋窝淋巴结转移乳腺癌组和淋巴结未转移乳腺癌组差异性蛋白筛选结果 通过对腋窝淋巴结转移乳腺癌组与淋巴结未转移乳腺癌组中癌组织对比分析，排除癌旁及正常乳腺组织配对分析得出差异蛋白影响，最终得出87个差异蛋白位点，其中表达上调47个、表达下调40个。比较两者差异蛋白位点序号及差异倍数，淋巴结转移乳腺癌组织中高表达的蛋白前3位为核基质结合区结合蛋白1(SATB1)、埃兹蛋白(Ezrin)、微管解聚蛋白(Stathmin)，低表达的蛋白前3位分别是钙黏附蛋白(E-cadherin)、Maspin蛋白、肿瘤转移抑制基因蛋白(KAI-1)。乳腺癌组织中差异表达蛋白位点质谱分析见图1。

图1 乳腺癌组织中差异表达蛋白质谱分析图

2.3 腋窝淋巴结转移和未转移乳腺癌组织中的差异表达蛋白验证结果 腋窝淋巴结转移乳腺癌组织Ezrin、Stathmin蛋白表达阳性率高于未转移乳腺癌组织，E-cadherin蛋白表达阳性率低于未转移组织(P均<0.05)。见表2。

表2 腋窝淋巴结转移与未转移的乳腺浸润性导管癌组织中差异表达蛋白检测结果比较(例)

3 讨论

乳腺癌的进展是一个复杂的过程，一些蛋白如Bmi-1、EZH2蛋白在乳腺癌转移过程中发挥了一定作用[2]，这些蛋白引起乳腺癌转移的机制是肿瘤研究的热点。乳腺癌疾病进展出现腋窝淋巴结转移，淋巴结转移将影响乳腺癌的预后。本研究采用二维凝胶电泳的方法分离乳腺浸润性导管癌组织内蛋白质，分析腋窝淋巴结转移和未转移者的差异表达蛋白，通过对差异性蛋白位点的鉴定，寻找可能在乳腺癌疾病发展及转移过程中起到关键作用的蛋白。

本研究发现，合并腋窝淋巴结转移的乳腺浸润性导管癌组织中，有几类蛋白表达出现了明显变化。其中黏附蛋白表达差异最为明显，在淋巴结转移组高表达的蛋白有SATB1、Ezrin、Stathmin，低表达蛋白有E-cadherin、Maspin、KAI-1。部分蛋白在乳腺癌中差异表达，已有文献[3～5]报道证实。经过免疫组化验证，Stathmin、Ezrin、E-cadherin蛋白在两组乳腺癌癌组织标本中表达异常。这些蛋白可能在乳腺癌发生转移过程中起重要作用。

SATB1蛋白与乳腺癌的生长、转移及预后等有密切的关系[6]。SATB1蛋白表达能诱导细胞的侵袭表型，从而促进肿瘤的生长和转移[7]。研究发现，在有淋巴结转移乳腺癌组中SATB1蛋白表达量高。本研究结果显示，在淋巴结转移乳腺癌组和淋巴结未转移乳腺癌组中SATB1蛋白表达并无差异，可能因为标本量偏小出现偏倚，需要后续扩大样本含量或者采用蛋白质印迹法进一步研究。

E-cadherin位于细胞膜上，是一种重要的细胞黏附糖蛋白，是细胞生长的接触抑制剂，能够抑制瘤细胞侵袭转移[8]。文献报道，肿瘤细胞发生上皮间叶转化，E-cadherin表达降低、功能缺失，细胞膜间黏附力下降、丢失极性，癌细胞可脱离癌巢，出现远处转移。研究显示，E-cadhenrin在多种肿瘤的功能缺失与肿瘤的转移及预后有密切联系[9,10]。

Ezrin蛋白是一种酪氨酸激酶的底物，能在细胞膜蛋白与肌动蛋白骨架之间起到桥梁作用。Ezrin蛋白与乳腺癌细胞的黏附、凋亡、增殖、侵袭转移相关，并参与肿瘤血管生成的调节[11]。本研究结果显示，乳腺癌组织Ezrin表达水平高于癌旁正常组织，表明Ezrin高表达可促进乳腺癌的发生发展，检测乳腺癌组织Ezrin表达有助于乳腺癌的早期诊断和病情评估。

Stathmin是一种高度保守的细胞质蛋白，通过被蛋白激酶磷酸化影响微管形成及细胞有丝分裂过程，调节细胞周期，从而影响细胞的增殖、分化及功能。Stathmin蛋白与乳腺癌的发生发展密切相关，还与乳腺癌的分化程度及增殖有关。艾冬梅等[12]认为，Stathmin是乳腺癌发生的重要因子，可能成为乳腺癌早期诊断、判断预后及基因治疗的新靶点。

Maspin基因是一种抑癌基因，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员。文献报道，Maspin存在于正常的上皮组织如乳腺导管上皮、口腔黏膜上皮、胃肠道黏膜上皮中,在正常组织中Maspin呈现高水平表达，在恶性肿瘤中其含量明显降低[13],在乳腺癌组织中呈低表达。

肿瘤抑制因子KAI-1在许多癌症中被下调或丢失并与预后不良有关。研究发现,乳腺癌组织中KAI-1蛋白阳性表达显著低于正常乳腺组织，提示在乳腺癌组织中存在KAI-1表达下降或缺失，特别是在伴淋巴结转移、远处脏器转移肿瘤中的表达较非转移者比较明显降低[14]。

综上所述，腋窝淋巴结转移与未转移的乳腺浸润性导管癌在组织蛋白表达上存在很多差异，提示乳腺癌的淋巴结转移过程是多种蛋白共同作用的结果。对转移相关蛋白进行研究有助于阐明蛋白质在乳腺癌腋窝淋巴结转移中的作用，进一步阐明肿瘤转移的机制。