金宇 陈恒玲 林显光

摘要：指出了阿片类药物诱导的痛觉过敏（Opioid-induced hyperalgesia，OIH）是临床上的一个棘手问题，由于其发生机制尚不明确，故目前还没有一种良好的治疗方法。背根神经节（Dorsal root ganglia，DRG）是感觉传递的初级神经元所在部位，是机体疼痛信号处理乃至编码和传递的重要部位。已有研究认为阿片诱导的痛觉过敏也涉及DRG，但DRG参与阿片诱导的痛觉过敏的具体机制不详。为此，在动物模型的基础上筛选出了可能参与痛觉过敏发生的基因Crtacl，对其参与大鼠痛觉过敏的机制分别开展了初步的研究。首先，在大鼠颈部皮下反复注射枸橼酸芬太尼构建OIH模型，通过甲基化测序发现Crtacl在OIH组的DRG中与对照组的有显著差异。其次，通过半定量PCR发现Crtacl基因表达量在OIH大鼠的DRG中明显上调，这说明Crtacl可能在DRG水平上参与着痛觉过敏的发生。针对在DRG上参与OIH的调控作用进行的研究，有助于研究OIH的发生机制和信号通路，提供新的潜在治疗OIH的药物靶点。

关键词：OIH;芬太尼;背根神经节;基因Crtacl

中图分类号：Q71 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）20-0144-03

1引言

在日常生活中，疼痛一直都是非常令人讨厌的，但是当身体发生疾病或者处于危险境况的时候，它却提供了明确的危险信号。一直以来，疼痛的感知和传递都是重要的研究对象。临床上，阿片类药物常被作为手术过程中的麻醉剂，其镇痛效果十分明显。但是，停药数小时以后往往会出现一个与其镇痛效果相矛盾的现象，镇痛效应转变为痛敏效应。研究者把这个现象称为阿片类药物诱导的痛觉过敏（opioid-induced hyperalge-sia，OIH）。OIH是目前临床上难以解决的问题，有关OIH的信号通路和发生机制仍然很不明确。背根神经节（Dorsal root ganglia，DRG）细胞可以对外周伤害性疼痛信号进行处理和传递，它在疼痛的研究中一直扮演着重要角色，在探究痛敏形成机制和痛觉传导机制时都离不开DRG细胞。

通过甲基化测序筛选芬太尼诱导痛觉过敏在大鼠DRG中的相关基因，发现相比于对照组Crtacl这个基因在0IH组有明显上调，其p值为0.0167，LogFC值为-1.92217，甲基化测序结果如图1所示。

Crtacl（软骨酸性蛋白1）是人类软骨组织的细胞外基质蛋白，也存在于眼睛和神经系统中。Crtacl在脊椎动物、非脊椎动物等真核生物以及一些原核生物中表达，并在生物进化的过程中被保留下来，表明它具有十分重要的作用。Crtacl的结构模型显示，它属于β类蛋白，且族哺乳动物的某些疾病，包括阿尔茨海默症等淀粉样蛋白病相关。近年来也有研究表明Crtacl与人类晶状体上皮细胞凋亡关系密切，且可能成为白内障治疗的新靶点。然而目前有关痛觉过敏的文献中很少见对这个基因的研究和探讨。在痛觉过敏的研究中，将OIH与DRG联系在一起进行研究的也并不多。本研究通过PCR技术确定Crtacl基因在mRNA水平上的表达差异，旨在为研究OIH发生机制提供一些参考并为治疗OIH提供新的可能的靶点和方法。

2材料与方法

2.1实验材料

本课题使用的实验动物均来自湖北疾控中心实验动物中心，为无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）的Sprague Dawley（SD）实验大鼠，体重60～80g。实验期间动物房温度保持23士2℃，光照一黑暗时间12～12h，期间自由进食饮水，保证实验动物处于健康且安静的状态。实验動物的饲养方法和条件、使用及处死均符合有关法律和规章的要求。在大鼠颈部皮下反复注射枸橼酸芬太尼构建OIH模型后，该模型鼠用于背根神经节RNA提取及后续的半定量PCR实验。

2.2痛觉过敏模型的制备

参考文献提供的方法，测量SD大鼠机械刺激缩足阈（PWMT，g）。选取痛阈均在正常水平的大鼠，造模前一天随机将大鼠分成对照组和痛觉过敏组，对两组大鼠进行上述痛阈测定（DO值）。痛觉过敏组在大鼠颈部进行皮下注射枸橼酸芬太尼注射液，从而制备OIH动物模型。单次注射剂量为60ug/kg，每隔15min注射一次，共四次，总注射剂量为240ug/kg。对照组在颈部进行皮下注射，以相同的时间间隔注射与痛觉过敏组相同体积（约1.2mL/kg）的生理盐水。

2.3总RNA的提取和cDNA的制备

参考文献[11，12]提供的标准实验流程，用TRIzol法提取总RNA。紫外分析RNA样品，计算其A260/A280、A260/A230的值。一般认为，质量高的RNA样品，A260/A280应为1.8～2.0，A260/A230应大于2.0。经分析合格后，每个样品中加1uL RRI（RNA酶抑制剂）后，-80℃保存备用。

以总RNA为模板，按照擎科GoldenstarTM RT6cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒说明书进行逆转录。反应结束后将得到的cDNA模板置于-20℃中保存。

2.4半定量PCR（Reverse Transcription PCR。RT-PCR）分析

半定量PCR的引物由Primer 5设计，内参基因为Hprtl，表1为RT-PCR的反应引物序列。

按表2加入各组分。实验的先决条件是将内参基因Hprt调平，通过调整加样量，使整个反应体系中对照组和实验组的cDNA模板量一致，进而比较目的基因表达量的差异。

结合Primer 5给出的退火温度（Tm值）设定不同的阶梯温度进行一次PCRl3，根据结果分析选用最适宜的退火温度。最终按照如表3的条件进行扩增。

3结果与分析

3.1利用芬太尼制备大鼠痛觉过敏模型。并在不同时

间点对其机械痛进行测量。与对照组进行比较

对比Saline组来看，大鼠颈部皮下注射芬太尼之后的4h内，Fentanyl组大鼠的机械痛阈（PWMT）明显升高（P<0.001），芬太尼表现为明显的镇痛效应;从第5个小时开始，Fentanyl组大鼠的PWMT的值便开始下降，持续的在5h、6h、7h、8h、9h、12h、D1、D2、D3中均明显的有下降趋势（P<0.05），且在6.5h时出现了机械痛阈和热痛阈值的最低点（P<0.001），此时芬太尼诱导的痛觉过敏现象最为明显;由第4天（D4）开始，Fenta-nyl组大鼠的痛阈开始回升，其PWMT的值与Saline组相比，差异不具有统计学意义（P>0.05），直到第5天（D5）测量结束，二者均没有反弹迹象，认为其痛阈已恢复至正常水平。结果展示见图2。

3.2Hmgcs2基因在痛觉过敏大鼠的DRG中mRNA表达量的变化

将大鼠进行随机分为两组，一组注射生理盐水为Control组，一组注射芬太尼为OIH组，注射方式见本文2.2小节。在确认造模成功后立即将大鼠的DRG急性分离，快速进行RNA提取，进行逆转录和半定量PCR。以Hprtl为内参基因，实验结果如图3所示，在mRNA水平上，基因Crtacl在OIH大鼠的DRG中表达量上调。

4结论与展望

一直以来，疼痛都是人类健康的最大“敌人”之一，也严重的影响着人类的生活质量。而人们也一直没有停止与之對抗，随着越来越深入的研究报道，越来越多治疗疼痛的新的药物靶点被发现，而临床上用于镇痛的“金标药”依旧是阿片类药物。但是使用阿片类药物所带来的痛觉过敏症状依旧是一个棘手的问题。所以，本课题成功构建芬太尼诱导的大鼠痛觉过敏模型，并以此模型为基础进行后续实验研究。对大鼠DRG进行提取，通过甲基化测序筛选出在OIH状态下具有显著性差异的基因Crtacl。将成功造模后的大鼠急性分离DRG提取RNA进行PCR实验，可以发现在mRNA水平上，Crtacl的表达量在OIH大鼠DRG中有明显的升高。

干涉DRG中的Crtacl表达，可能在一定程度抑制芬太尼诱导的痛觉过敏发生。然而目前关于Crtacl参与OIH以及其作用机制还没有相关报道。本课题的研.究内容至少在DRG上一定程度上揭示了，Crtacl可能在OIH发生的过程中扮演了重要角色，未来的研究可以将Crtacl作为潜在的治疗OIH的新靶点。