田野，李亚楠，吴征，王紫薇，陈凤莲，曲敏

(哈尔滨商业大学食品工程学院黑龙江省普通高校食品科学与工程重点实验室,哈尔滨 150076)

植物冰结构蛋白(ice structural proteins，ISPs)，又称热滞蛋白(thermal hysteresis protein，THP)或抗冻蛋白(antifreeze protein，AFPs)，是植物体经低温诱导后产生的抗逆蛋白，普遍存在于寒冷、高海拔地区的越冬植株体内[1,2]，通过控制冰晶生长和抑制细胞外重结晶，以减小大冰晶对机体的损伤。相比鱼类和昆虫ISPs，植物ISPs具有热滞活性低和较强的重结晶抑制功能[3]，通过范德华表面张力的作用以及可能参与的氢键作用使冰核和ISPs紧密结合，从而抑制冰核生长[4]。植物ISPs的起步较晚，19世纪末，Griffith等[5]首次在冬黑麦叶子中分离纯化ISPs，随后在许多多年生的植物，如胡萝卜(Daucuscarota)、小麦(Triticumaestivum)、女贞叶(Ligustrumlucidum)、苜蓿(MedicagosativaL.)等40余种植株体内检测出ISPs[6-9]。2006年，我国卫生部公布ISPs可以作为新型食品添加剂添加到冷冻食品中。由于鱼类ISPs价格昂贵，不适于在大规模的食品工业加工中应用，因此，探索来源广泛、价格低廉、食物源的植物ISPs成为研究热点。

分蘖洋葱(AlliumcepaL.var.multiplcansBailey syn.var.AgrogatumDon)又名毛葱或珠葱，为百合科葱属，植株丛生，分蘖能力强[10]。分蘖洋葱生育期短，适宜在黑土地生长，具有很强的抗寒性，是黑龙江传统栽培品种[11]。本研究采用冰结合磷酸盐缓冲溶液法提取分蘖洋葱冰结构蛋白(Alliumice structural proteins，AISPs)，采用SDS-PAGE确定AISPs的分子量，并将其应用于安琪酵母的抗冻保护中以期得到廉价的植物食物源ISPs，拓宽ISPs的种质资源，并对分蘖洋葱抗冻机理提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜分蘖洋葱(市售)：产地黑龙江；安琪耐低糖高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；磷酸氢二钠、无水乙醇、甘油、甲醇：天津市天力化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G250、考马斯亮蓝R250：上海迈坤化工有限公司；十二烷基硫酸钠：北京生东科技有限公司；冰醋酸：上海豪申化学试剂有限公司；溴酚蓝：沈阳先创化工有限公司；二硫代苏糖醇：上海前尘生物科技有限公司；Tris buffer：上海叶舟生物科技有限公司；丙烯酰胺、TEMED、蛋白Marker：天津市旭泰化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TGL-16型高速台式离心机 上海医疗器械六厂；BCD-216YH电冰箱 美的集团；SDS-PAGE电泳仪、R-205旋转蒸发仪 北京市君意机电技术公司；UV-紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；DL-1冷冻干燥机 宁波市双嘉仪器有限公司；ESJ 180-4型电子天平 沈阳龙腾电子称量仪器公司；DYCZ-24DN粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；LG10磁力搅拌器 天津市欧诺仪器仪表有限公司；SHB-1循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；Motic BA200电子显微镜 深圳显盛仪器有限公司。

1.3 AISPs的提取

1.3.1 提取方法及工艺流程

AISPs提取工艺流程图见图1。

图1 AISPs提取工艺流程图

1.3.2 单因素试验

由于ISPs具有能结合于冰表面并与冰形成不可逆的结合特点，本研究采用本组改进的冰结合PBS溶液法提取AISPs。分别考察磷酸缓冲溶液(PBS)的浓度、料液比、冰球添加量对AISPs提取率的影响。

将新鲜分蘖洋葱去皮，除杂洗净，切成小块放入粉碎机中粉碎，并用4层纱布过滤取汁，弃去滤渣。将滤汁于4000 r/min离心5 min，收集上清液。将上清液与PBS溶液混合，在磁力搅拌器作用下连续搅拌1.5 h，设定转速为800～1000 r/min。采用考马斯亮蓝法测定此时蛋白含量，计算质量，记为M1[12]。

在搅拌提取后的溶液中加入直径为1 cm的冰球，在-18 ℃环境下静置2 min，分离出冰球并弃去溶液，收集冰球待自然融化，测量此时蛋白含量，计算质量，记为M2。

待蛋白冰提液于旋转蒸发仪上浓缩后，在-18 ℃下冷冻，待冷冻透彻后放入冷冻干燥机中制成蛋白质冻干粉。

1.3.2.1 PBS溶液的浓度对AISPs提取率的影响

离心除杂后的分蘖洋葱滤汁中加入5倍体积pH 8.0的PBS溶液，浓度分别为80，100，120，140，160 mmol/L进行提取，计算蛋白提取率。

1.3.2.2 料液比对AISPs提取率的影响

在离心除杂后的分蘖洋葱滤汁中加入pH 8.0，浓度为100 mmol/L的PBS溶液，按料液体积比分别为1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9进行提取，计算蛋白提取率。

1.3.2.3 冰球添加量对AISPs提取率的影响

分别按每100 mL混合液20，30，40，50，60个的比例加入冰球，在-18 ℃环境下静置2 min。

1.3.3 响应曲面

根据单因素试验结果，采用响应面法对AISPs提取工艺进行优化，选取料液体积比(A)、缓冲溶液的浓度(B)和冰球的添加量(C)为考察因素，以蛋白提取率为考察指标，进行响应面试验，见表1。

表1 响应面分析试验设计因素与水平

采用BBD试验设计方法设立17组试验，各因素和响应面值(蛋白提取率)见表2，对数据进行二次回归拟合，分析各因素的效应，最后得到AISPs提取最佳工艺。

(1)

式中：M1为冰提前混合液中的蛋白质含量(mg)；M2为冰提后的蛋白质含量(mg)。

1.4 冰结构蛋白全波长扫描

称取AISPs冻干粉加入蒸馏水配制成浓度为0.5%的蛋白溶液，使用pH 8.0，浓度为91.87 mmol/L的PBS溶液做对照，用UV-紫外可见分光光度计做全波长紫外扫描。

1.5 SDS-PAGE电泳

本试验根据曲敏等的方法进行SDS-PAGE凝胶电泳。

1.6 AISP对酵母的保护作用

用YPD培养基将市售安琪酵母干粉活化，制成酵母细胞悬液。取5组菌液分别加入0%、0.5%、1%、1.5%、2%浓度梯度的AISPs，将其放入温度为-18 ℃的冰箱中进行冷冻处理，以1 d为1个周期，冻融5个周期。采用平板划线法对每个周期的酵母存活数进行测定。用美兰染剂染色后，于40×显微镜下观察拍照菌体形态。

2 结果与讨论

2.1 蛋白标准曲线的测定

图2 蛋白标准曲线

由图2可知，蛋白溶液的吸光值与酪蛋白浓度存在正比例关系，线性关系良好，可用于后续试验。

2.2 PBS溶液浓度对AISPs提取率的影响

图3 PBS浓度对蛋白提取率的影响

由图3可知，随着PBS溶液浓度的增加，蛋白的提取率呈现先增加后降低的趋势。当PBS浓度在80～100 mmol/L时，洋葱蛋白所带的电荷不断增多，蛋白与水之间的相互作用不断增大，蛋白与蛋白之间的相互作用不断减小[13，14]，AISPs提取率逐渐增大。当PBS溶液浓度达到100 mmol/L时，洋葱蛋白已经达到最大的溶解限度，蛋白中的氢键断裂，提取率达到最大值，为38.15%。表明磷酸溶液浓度的增加有利于分蘖洋葱中的蛋白更充分地溶解于PBS溶液中，从而提高蛋白提取率。而当提取达到饱和时，增加PBS溶液的浓度，则会导致AISPs提取率下降，综上，冰法提取AISPs的PBS溶液最适浓度为100 mmol/L。

2.3 料液比对AISPs提取率的影响

图4 料液比对蛋白提取率的影响

由图4可知，随着料液比的增加，蛋白的提取率逐渐增大，当料液比达到1∶5时，提取率达到最大值，此后蛋白提取率随着料液比的增大反而减小。试验结果表明，料液比的增加有利于分蘖洋葱中的蛋白更充分地溶解于PBS溶液中[15]。而当料液比大于溶剂用量时，则会导致单位液体中AISPs的含量相对减少，从而降低冰结构蛋白的含量。综上，冰法提取AISPs的最适料液比为1∶5。

2.4 冰球添加量对AISPs提取率的影响

图5 冰球添加量对蛋白提取率的影响

由图5可知，随着冰球添加量的逐渐增加，蛋白提取率逐渐增高，当冰球添加量达到30个/dL时，提取率达到最大值，此后随着冰球数的逐渐增加，蛋白的提取率开始下降。这是由于随着冰球的不断增加，冰结构蛋白与冰球接触的表面积不断增加，有利于冰与冰结构蛋白之间的特异性结合。随着冰球数量的增加，冰结构蛋白逐渐被提取完全。而当冰球过量时，则相当于在提取蛋白溶液中增加溶剂，使冰结构蛋白浓度降低，导致提取率下降。冰法提取AISPs的最适冰球添加量为30个/dL。

2.5 AISPs提取工艺优化

2.5.1 回归方程的建立与方差分析

利用软件对试验结果见表2。

表2 AISPs提取率响应曲面试验设计和结果

进行回归分析，拟合得到AISPs提取率的二次元回归方程为：

Y=67.01+2.43A+2.83B+2.16C+4.94AB+2.84AC+3.58BC-12.6A2-12.14B2-6.4C2。

(2)

表3 AISPs提取率回归模型

由表3可知，失拟项不显著，表明模型的拟合程度良好，未知因素对试验结果的干扰较少，模型的方差分析说明该模型已经达到显著水平(P<0.05)。由P值可知各因素对AISPs提取率的影响为：冰球个数>料液比>PBS浓度。校正系数RAdj2为0.95，变异系数(C.V.)为7.33%<10%，决定系数R2为0.98，说明多项式模型的利用性和精密度是可行的，通过此模型方程能预测出AISPs在任何变量值下的提取率。

2.5.2 响应面分析及验证

因素(料液比、PBS浓度、冰球添加量)交互影响的响应面图和等高线图，见图6～图8。

图6 料液比和PBS溶液浓度对蛋白提取率的交互影响

由图6可知，随着料液比的增大，冰结构蛋白提取率呈现先增加后缓慢降低的趋势。PBS浓度为80～120 mmol/L时，提取率呈现先增大后减小的趋势；等值线区域水平表示料液比与PBS浓度之间具有显著的交互作用。

图7 料液比和冰球数量对蛋白提取率的交互影响

图8 PBS溶液浓度和冰球数量对蛋白提取率的交互影响

由图7可知，随着冰球数量的不断增加，提取率呈现先增大后趋于平稳的趋势；随着料液比的逐渐增大，提取率呈现先增大后减小的趋势。

由图8可知，随着PBS溶液浓度的不断增高，提取率呈现先增大后减小的趋势。

通过二次多项式回归分析求最大值，得到AISPs的最佳工艺为：分蘖洋葱滤汁与PBS溶液的体积比为1∶5.32，PBS浓度为91.87 mmol/L，冰球添加量为32.57个/dL，在此条件下，AISPs提取率的理论预测值为67.753%。结合最优工艺参数和实际生产可操作性，对各因素进行修订，最终确定最优工艺为：分蘖洋葱滤汁与PBS溶液的体积比为1∶5.32，PBS浓度为91.87 mmol/L，冰球添加量为33个/dL。在最佳工艺条件下，经过3次重复试验验证，AISPs的提取率为65.23%，与预测值相近，说明优化工艺重复性良好，最优工艺的结果可靠。

2.6 全波长扫描结果

图9 全波长扫描曲线图

由图9可知，在波长200～500 nm范围内对蛋白溶液进行紫外-可见光图谱扫描，可见AISPs在波长为280 nm处有最大吸收峰，且其他波长处曲线较平缓，未见明显杂峰，而蛋白溶液的紫外-可见分光光谱的最大吸收峰在280 nm波长附近。可知提取的蛋白纯度较高，说明溶液有蛋白质性质，蛋白粉中有微量杂质或小分子肽存在，属于正常范围内，进而可以说明本试验采用AISPs法提取的蛋白纯度较高，方法可行。

2.7 AISPs分子量的确定

图10 SDS-PAGE电泳胶片

注：0为Marker；1,2为AISPs。

由图10可知，SDS-PAGE电泳结果显示AISPs由4个蛋白组分组成，其相对分子量分别约为52，29，22，15 kDa。其中，52，22，15 kDa 3个条带颜色较深，显示该3个组分含量较高。AISPs条带较为清晰、笔直颜色较窄，没有出现明显的拖尾，说明具有较高的灵敏度和较好的重复性，同时，再次说明冰结合磷酸缓冲溶液法制备的AISPs纯度较高，方法可行。

2.8 AISPs对酵母的抗冻保护作用

图11 耐低糖安琪酵母菌落形态与菌体图(40×)

注：A为安琪酵母菌落图(稀释涂布105倍)；A1为安琪酵母菌体形态图；B为对照、未加AISPs冻融5 d/次的安琪酵母菌落图(稀释涂布105倍)；B1为对照、未加AISPs冻融5 d/次的安琪酵母菌体形态图(蓝色为死亡酵母)；C为1% AISPs、冻融5 d/次的安琪酵母菌落图(稀释涂布105倍)；C1为1% AISPs、冻融5 d/次的安琪酵母菌体形态图。

由图11可知，耐低糖安琪酵母菌体呈椭圆形，菌落形态为乳白色的半圆珠形，具有光泽，平坦，边缘整齐。未加AISPs、冻融5 d/次的安琪酵母大量死亡，冷冻使酵母细胞壁遭到破坏，美兰染液进入细胞，呈现蓝色；而加入AISP，大部分酵母在AISPs的保护下仍具有很高的存活率。

图12 不同浓度AISPs对安琪酵母菌活菌数量的影响

逆境条件下，尤其是冷冻会使酵母的新陈代谢变慢，同时影响酵母细胞的RNA二级结构、蛋白质翻译率和折叠速率，降低细胞膜的流动性，导致错误折叠蛋白质积累、酶失活、营养物质转运速率和细胞繁殖速率的降低，甚至使细胞处于休眠状态[16,17]。

由于植物ISPs具有很强的修饰冰晶形态与抑制重结晶的特性，它可以保护细胞免受由低温造成的破坏，避免体液结为大的冰晶[18]。由图12可知，在冷冻胁迫条件下，酵母菌落数随着冻融周次的不断增加呈不断下降的趋势。其中空白对照组在冻融第5周期时活菌数为3.57×105个，存活率为25.89%。而加入不同浓度的 AISP使酵母存活率得到明显提高，其中1.0% AISPs添加量时酵母菌活菌数最高，菌落数达到6.73×105个，存活率为51.45%，与对照组相比，活菌数提高了88.5%，存活率提高了25.56%。说明AISP对反复冻融的耐低糖酵母细胞具有很好的抗冻保护作用。刘朋帅[19]将小胸鳖甲ISPs(MpAFP698)添加入大肠杆菌菌液中，发现ISPs浓度在0.005～0.08 mmol/L时，保护作用越明显，与本研究的结论一致。

3 结论

通过单因素和响应面法优化AISPs提取率试验，得到最佳工艺参数为：分蘖洋葱滤汁与PBS溶液的体积比为1∶5.32，PBS浓度为91.87 mmol/L，冰球添加量为33个/dL，此时AISPs提取率为65.23%。

全波长紫外扫描AISPs溶液，在280 nm处出现最大吸收峰，说明其具有蛋白性质并且纯度较高。利用SDS-PAGE确定了AISPs有4个蛋白组分组成，其分子量分别为52，29，22，15 kDa。

将AISPs添加到耐低糖酵母菌悬液中，当AISPs添加量为1.0%、冻融5 d/次时，酵母菌的活菌数最高，菌落数为6.73×105个，存活率为51.45%，分别比对照组提高了88.5%和25.56%。