岳圆圆 全英杰 任镘蓉

摘要：研究贡菊花蕾期、露白期、初花期和盛花期中木樨草苷、绿原酸和异绿原酸含量及其相关CmFNS1、CmC3H、CmHQT基因相对表达量的变化，为确定贡菊最佳采收时期提供理论依据。结果表明，绿原酸、木樨草苷和异绿原酸的含量都在露白期迅速下降，初花期上升，盛花期逐渐下降，其中在初花期含量最高，分别为 0.43%、0.27%和0.33%。利用实时荧光定量PCR检测CmFNS1、CmC3H、CmHQT基因的相对表达量发现，这些基因表达量变化呈现出横向“S”形，并在初花期达到最高值，与木樨草苷、绿原酸、异绿原酸含量的变化趋势相似，进一步表明贡菊在初花期木樨草苷、绿原酸、异绿原酸含量最高。

关键词：绿原酸;木樨草苷;异绿原酸

中图分类号： S682.1+10.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）17-0165-04

菊花[Chrysanthemum morifolium （Ramat） Tzvel.]为菊科多年生草本植物，具有较高的观赏价值和药用价值，根据菊花的用途可分为观赏性菊和功能性菊。功能性菊包括药用菊、茶用菊和食用菊3种[1]。贡菊是功能性菊花栽培的主要品种之一，其朵大瓣宽，中心为黄色，蒂呈绿色，生长在安徽省南部海拔较高的山区，贡菊不仅是茗饮佳品，还是名优药材。《中华人民共和国药典》规定绿原酸、异绿原酸和木樨草苷为药用菊的主要成分[2]。绿原酸、异绿原酸和木樨草苷都是通过苯丙氨酸代谢途径合成的，木樨草苷合成的直接前体是p-香豆酸酰CoA和3-丙二酰CoA，在一系列酶的催化作用下最终合成木樨草苷，其中关键的合成酶是黄酮合成酶（flavone synthase，简称FNS）[3];香豆酸-3-羟化酶（p-coumarate-hydroxylase，简称C3H）和羟基肉桂酰辅酶A奎尼羟基肉桂转移酶（hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase，简称HQT）等为绿原酸和异绿原酸合成的关键酶[4]，编码这些酶的基因表达也同样反映物质的积累，在咖啡中HQT、C3H、HCT等基因的表达量增加，绿原酸含量也随之增加[5]，这些编码酶的功能基因表达主要受到植物发育期和外界环境等因素的影响。

不同的采收时间对药用菊主要活性成分含量的影响较大，陈志莲报道，野菊从花蕾期到盛开期黄酮含量逐渐降低[5];梁迎暖等研究显示，随着怀菊花期的到来，黄酮和绿原酸含量呈现先升高后下降的变化，最佳的采收时期为70%的花开放时期[6];杨俊等检测了杭白菊黄酮和绿原酸含量的变化，结果发现，绿原酸含量未发生变化，黄酮含量随采收期推迟呈下降趋势[7]。由此可见，不同菊花品种在不同采收时期的活性物质含量变化不同。目前，关于贡菊采收时期与活性物质含量变化关系的研究未见报道。因此，本试验以贡菊为材料，研究花蕾期、露白期、初开期和盛开期4个时期花序中绿原酸、木樨草苷和异绿原酸含量的变化及其关键基因的表达量，为确定贡菊最佳采收期提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将贡菊扦插苗移栽到含腐殖土、珍珠岩（体积比为3 ∶ 1）的花盆中，移到延边大学农学院温室进行培养，温度为（25±2） ℃，相对湿度为70%。贡菊现蕾后按照蕾期、露白期、初花期和盛花期选择顶芽花进行采集（图1），放到液氮中带回

实验室，于 -80 ℃ 超低温冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制备 称取绿原酸、木樨草苷和异绿原酸各1.5 mg，分别加入1.95 mL 70%的甲醇溶液，振荡摇匀，使其充分溶解，获得标准对照品母液（0.769 mg/mL），再将其配制成0.25 mg/mL的混合对照标准品母液，分别将其稀释成浓度为0.250、0.200、0.125、0.100、0.062、0.031和 0.017 mg/mL 的7种不同浓度的混合标准对照品溶液，用高效液相色谱仪（Agilent 1260）进行分析。色谱条件如下：以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗提程序为 0～11 min，10%～18% A;11～30 min，18%～20% A;30～40 min，20% A;40～45 min，20%～10% A;流速为1 mg/mL，检测波长为350 nm，柱温为40 ℃，进样量为5 μL。记录峰面积，以各标准浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算绿原酸、木樨草苷和异绿原酸含量的线性关系。

1.2.2 样品溶液的制备与测定 取不同花期的干燥样品，分别用打碎机打碎，称取样品粉末0.25 g，分别置于具塞锥形瓶中，加入25 mL 70%色谱级甲醇溶液，盖上塞子，封闭放置。超声处理（120 W，40 kHz）40 min，冰浴冷却至室温，5 000 r/min 离心30 min，上清用旋转蒸发仪浓缩处理，冷却至室温，用2.5 mL 70% 色谱级甲醇溶液溶解，取溶液经微孔滤膜过滤后测定。

1.2.3 贡菊RNA的提取及反转录 采用RNA提取试剂盒（RNAiso Plus）分别提取贡菊不同花期的RNA，采用NanoDrop ND-2000型微量核酸蛋白定量测定仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]测定RNA浓度和质量。利用反转录试剂盒（天根生化科技有限公司），按照说明书将1 000 ng RNA合成cDNA第1链，于-20 ℃保存备用。

1.2.4 相关基因的表达分析 根据菊花转录组数据，分别找到CmFNS1、CmC3H、CmHQT基因的序列，并在3′端序列设计特异性引物FNS1-F、FNS1-R、C3H-F、C3H-R、HQT-F、HQT-R（表1），采用荧光定量PCR仪（Agilent 3005）进行定量分析，反应程序如下：95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40个循环。最后加入溶解曲線程序，以EF1α基因为内参，每个样品重复3次，采用2-ΔΔCT公式计算基因相对表达量。

1.3 数据分析

每个试验处理设3次重复，数据用SPSS 11.0软件进行统计分析，采用邓肯氏新复极差法作显著性差异分析，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 绿原酸、木樨草苷和异绿原酸标准曲线

将绿原酸、木樨草苷和异绿原酸标准样品配成不同浓度，分别取5 μL进样分析，分别以峰面积、质量浓度为纵、横坐标绘制标准曲线，得到回归方程（图2）。绿原酸的回归方程为y=4 521.6x+3.851 5（r2=0.998 7），木樨草苷的回归方程为y=22 136x-130.83（r2=0.992 8），异绿原酸的回归方程为y=12 521x-50.123（r2=0.997 1），标准曲线在标准品浓度范围内线性良好。

2.2 不同花期绿原酸、木樨草苷和异绿原酸的含量分析

贡菊在花蕾期、露白期、初花期和盛花期时绿原酸、木樨草苷和异绿原酸含量发生较大变化（图3）。绿原酸含量在花蕾期和初花期较高，分别为0.33%和0.43%，在露白期和盛花期较低;木樨草苷在花蕾期和露白期含量较低，初花期含量达到最高值，为0.27%，在盛花期含量又下降;异绿原酸含量同样也在初花期最大，为0.33%，其次是花蕾期和盛花期。贡菊中绿原酸、木樨草苷和异绿原酸的含量都在初花期时最高。

2.3 CmFNS1、CmHQT和CmC3H基因的相对表达量

CmFNS1是木樨草苷合成的关键基因，它编码黄酮合成酶。由图4可见，CmFNS1在贡菊花蕾期的相对表达量最高，露白期表达量降低，初花期表达量升高，盛花期表达量降低，呈现横向“S”形，这与不同花期木樨草苷含量的变化相一致;CmHQT和CmC3H分别编码羟基肉桂酰辅酶A奎尼酸转移酶和香豆酸羟化酶，是绿原酸和异绿原酸合成的关键酶，CmHQT和CmC3H基的因相对表达量在花蕾期最高，露白期迅速降低，初花期相对表达量缓慢升高，盛花期逐渐降低，CmHQT和CmC3H相对表达量的变化趋势与绿原酸和异绿原酸含量的变化趋势相似。

3 讨论与结论

3.1 绿原酸、木樨草苷和异绿原酸在不同花期含量的变化

药用菊的主要活性物质为绿原酸、木樨草苷和异绿原酸等，影响这些活性物质含量的主要有品种、采收期、气候条件等。刘莉等研究杭菊、贡菊和亳菊3种药用菊花时发现，亳菊中木樨草素含量最高[8];魏民等研究发现，野菊花中的菊花苷含量在花蕾期、初花期、盛花期、末花期中逐渐下降[9];刘沁等发现，雪菊在采收中期时总黄酮含量最高，而在采收末期时绿原酸含量最高，总酚含量却在采收初期最高[10]。在这些

影响因素中，采收期对活性物质影响较大而且容易调控。本研究发现，贡菊在不同采收期（花蕾期、露白期、初花期和盛花期）绿原酸、木樨草苷和异绿原酸活性物质含量均不同，都在初花期最高。贡菊花蕾期单花干质量低于盛花期干质量，单花木樨草苷、绿原酸含量在盛花期时分别为182、262 μg/mg，在初花期时分别为271、439 μg/mg，盛花期均小于初花期。并且盛花期的贡菊花色变淡，有些花粉散落，影响菊花品质，而初花期采摘后的贡菊，侧枝萌发的花朵比盛花期采收的侧枝花朵更大些，因此建议贡菊在初花期采摘。

3.2 绿原酸、木樨草苷和异绿原酸合成相关基因的表达

绿原酸、异绿原酸和木樨草苷合成都通过苯丙氨酸代谢途径，主要受到PAL、C3H、CHS、FNS、C3H、HQT等结构基因的表达影响。FNS包括黄酮合成酶Ⅰ（FNSⅠ）和黄酮合成酶Ⅱ（FNSⅡ）。FNSⅠ是一种可溶性的2-酮戊二酸和依赖Fe2+的双加氧酶，催化黄烷酮转化为黄酮，主要存在于伞形科中[11]，最近也在水稻和拟南芥中发现[12-13]。FNSⅡ属于细胞色素P450，它依赖于NADPH和氧分子的膜结合成单氧化酶，催化黄烷酮C-2和C-3之间形成双健转化为黄酮，存在于大多数植物中。在大豆[14]、水稻[15]、金银花[16]中超表达FNS基因，可促进黄烷酮合成黄酮（5，7-二羟基黄酮、芹黄素和木樨草素）。本研究发现，贡菊含有FNS1和FNS2，FNS1在不同花期的相对表达量变化与木樨草苷含量一致，FNS2的相对表达量未发生变化，这可能由于FNS2不参与木樨草苷合成。张静茹等研究发现，金银花愈伤组织中绿原酸的量随HQT基因表达量的升高而升高，C3H基因能够催化苯丙烷类代谢产物C3位置的羟基化，是苯丙烷类代谢中的1个关键酶，可参与多种苯丙素类代谢产物的合成，如木质素、绿原酸、迷迭香等[17]。荧光定量PCR检测结果显示，C3H和HQT相对表达量变化趋势与绿原酸和异绿原酸含量相似，这表明C3H和HQT参与绿原酸和异绿原酸合成。此外，还发现FNS1、C3H和HQT的相对表达量在花蕾期最高，而相应的木樨草苷、绿原酸和异绿原酸含量在初花期最高，这还需要进一步研究。

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