林晓姿 任香芸 何志刚 梁璋成 李维新

（福建省农业科学院农业工程技术研究所 福建省农产品（食品）加工重点实验室 福州 350003）

黄酒是世界上最古老的三大酿造酒之一，以米制曲、以曲制酒的工艺已在我国传承了3 000多年。传统酒曲主要有麦曲、小曲、红曲、乌衣红曲等，是以稻米为基质在特定生态环境下用成曲做母种培养发酵制成[1]。黄酒酿造行业存在的主要技术瓶颈之一是产品酸度控制问题，一般将酸度超过7 g/L称为中度超酸，酸度超过10 g/L称为酸败[2]。酒曲质量、酿造工艺及陈酿环境等因子是影响黄酒酸度的主要因素[3]。优质酒曲是优质黄酒酿造的首要要求，酒曲富集了曲霉、酵母菌和乳酸菌等多种微生物及其产生的丰富酶系，有“曲是酒之骨”之称[4]。不同地区的生产环境、制备工艺、气候条件及地理位置等差异形成了酒曲产品的菌群多样性，如曲霉是产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶等的关键菌[5-7]。酵母菌菌群决定了酒曲的酒精发酵能力，乳酸菌菌群则主导着酿造产品的酸感及风味，不同种属微生物间存在着竞争、共生、寄生、互营、拮抗等生态关系[8]。有研究表明，影响麦曲品质的两大主要因素是麦曲中的微生物和蛋白质[9]；麸曲基质的pH值明显影响微生物生长，进而影响相关发酵酶的活力[10]；选择蛋白质含量较低的精米有利于降低终产品高级醇的生成量[11]；红曲米色价在300～1 000 u/g之间的糖化力及发酵力比其它色价红曲米更强[12]，而鲜有对酒曲表征指标与其酿造产品品质进行相关性研究的报道。

作为红曲黄酒主产区，福建省各区域都有代表性极强的特色酿酒红曲米，红曲米主要以籼米为原料，在开放式环境中经红曲霉发酵制成，另有添加“曲公”制成的乌衣红曲[12]，因季节、批次、区域、制作者等不同，所培养的红曲品质难以保持一致，从而使得酿酒质量参差不齐。本文旨在通过研究红曲米表型特征及发酵特性指标与产品酸度间的相关性，解析酿造黄酒产品酸度的影响因子，为我省酒曲制备及黄酒生产提供产业技术支撑，为食品工业用米加工产业原料高效利用提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 红曲米样品

选取福建省各地区的代表性红曲米样品25份：福州市1份、漳州市1份、南平市1份、三明市2份、龙岩市2份、泉州市7份、宁德市11份，详见表1。

表1 福建省各地区红曲米样品信息Table1 The samples Hongqu rice of Fujian province

1.2 主要试剂和仪器

淀粉酶（AMS）测试盒，南京建成生物工程研究所；其它试剂均为国产AR级；研磨仪，德国IKA公司；恒温水浴锅DK-S28型，上海精宏公司；pH计PB-10，赛多利斯（上海）贸易有限公司；自动凯氏定氮仪K9840，济南海能公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵工艺 取5 kg装陶缸，用蒸汽杀菌30 min，8层纱布封口冷却，加入2.0 kg净水，分别加入表1中红曲米100.0 g，浸泡过夜，次日加入经浸泡、蒸煮、摊凉的糯米饭2.0 kg，搅拌混匀，两层纱布封口后置于（20±2）℃下发酵，定期搅拌通气，发酵30 d结束，压榨过滤得原酒。各样品平行处理2次。

1.3.2 检测指标与方法 分别取适量酿酒红曲米样品检测红曲 pH 值（X1）、干燥失重（X2）、容重（X3）、淀粉（X4）、蛋白质（X5）、总氨基酸（X6）等表观特征，以及液化力（X7）、糖化力（X8）等发酵特性，将每份样品按照1.3.1节的工艺进行发酵，检测发酵3 d时的发酵力（X9）及发酵结束后的产酒力（X10）及酒液总酸（Y）。

1.4 检测方法

1.4.1 表观特征 红曲米容重[12]：将样品放入1 L量筒，上表面与刻度平行，称量此时样品质量取2次平行测定结果的算术平均值作为测定结果，以干基计。

红曲pH值[13]：将样品碾磨成80目粉末后，精确称取10.00 g定容至50 mL，60℃水浴0.5 h，离心取上清液检测。

红曲米干燥失重[14]：称取适量样品，精确至0.0002 g，置于已在（105±2）℃烘至恒重的称量瓶中，放入（105±2）℃烘箱中烘至恒重，干燥失重为烘干前、后的质量变化百分比。

红曲米蛋白质[15]：将样品碾磨成80目粉末，称取适量样品，精确至0.001 g，移入干燥的500 mL定氮瓶中消化至液体呈蓝绿色并澄清透明，再用凯氏定氮仪进行酸碱中和滴定，同时做试剂空白试验。红曲米的蛋白质含量换算成干基计。

红曲米淀粉[16]：将样品碾磨成80目粉末，称取适量样品，精确至0.001 g，去除脂肪、可溶性糖后采用酸水解法进行检测，红曲米的淀粉含量换算成干基计。

红曲米总游离氨基酸[17]：将样品碾磨成80目粉末，称取适量样品，精确至0.001 g，红曲米的游离氨基酸含量换算成干基计，计算各游离氨基酸之和。

1.4.2 发酵特性 液化力[19]：采用淀粉酶（AMS）测试盒，将样品碾磨成80目粉末，称取适量样品，精确至 0.01 g，以磷酸缓冲液（PBS，pH 6.0）为溶剂，定容至50 mL，浸提0.5 h后过滤，收集滤液待用。底物缓冲液先于40℃浴温5 min后待用。取两只试管作为空白管和检测管，分别加入底物缓冲液0.5 mL，检测管另加样液0.1 mL，混匀，40℃水浴准确反应7.5 min，分别加入碘应用液0.5 mL，添加蒸馏水3.0 mL混匀，测定OD660nm，1 cm光径。液化力（U/g）=（OD空白-OD测定）÷OD空白×（0.4×0.5÷10）×（60÷7.5），定义 U 是 1 g样品在 40℃下与底物作用60 min水解1 mg淀粉为1个单位，结果以干基计。

糖化力[18]：将样品碾磨成80目粉末，称取适量样品，精确至0.01 g，用乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.6）定容至50 mL，浸提0.5 h后过滤，收集滤液，用乙酸-乙酸钠缓冲液稀释一定倍数，待用取两支50 mL比色管（A、B管），分别加入可溶性淀粉溶液5 mL和乙酸-乙酸钠缓冲液4 mL，摇匀，于40℃恒温水浴中预热5～10 min，在B管中加入待测酶液5.0 mL，立即记时，摇匀，在此温度下准确反应60 min后，立即向A、B管中各加氢氧化钠溶液0.2 mL，摇匀，同时将两管取出迅速冷却，并于A管中补加待测酶液5.0 mL作为空白对照。吸取上述A、B两管中的反应液各稀释一定倍数，分别取0.5 mL加入1.5 Ml DNS试剂，在沸水浴中加热5 min后取出迅速冷却至室温，加入10 mL蒸馏水，在波长520 nm处测定吸光值。同时制作0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL的葡萄糖标准曲线。

糖化力（U/g）=（OD空白-OD测定）÷K×14.2×n÷5，定义1个糖化力单位（U/g）即1 mL酶液在40℃、pH 4.6的条件下，1 h水解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖U/g；式中，K——葡萄糖标准曲线斜率；14.2——反应液总体积（mL）；n——稀释倍数；1/5——折算成1 mL酶液的量，结果以干基计。

发酵力[20]：按照1.3.1节发酵工艺进行酿造，称量发酵起始及发酵3 d的重量W起始和W3d，发酵力（%）=（W起始-W3d）÷W原料×100。

产酒力：按照1.3.1节发酵工艺进行酿造制备原酒，称量压榨所得原酒重量并检测原酒酒精度，按照酒精度15%（体积分数，20℃）折算，产酒力（%）＝（W原酒÷W原料）×（酒精度÷15%）×100。

1.5 数据处理

用数据处理软件SPSS 17.0版进行描述性统计、因子分析和回归分析，用*表示在0.05水平（双侧）上显著相关，用**表示在0.01水平（双侧）上显著相关。

2 结果与分析

2.1 红曲米的指标检测值与描述性统计

25份酿酒红曲米的10个指标检测结果见表2，为消除由于度量单位或平均数不同造成的方差分析效果不明确，对检测结果进行描述性统计并计算变异系数，结果见表3。变异系数最大的是3个发酵特性参数，样品间极值差距较大，即糖化力（X8）、液化力（X7）和发酵力（X9），其次是产品酸度。由于制备工艺及其附着的微生物菌群特性，红曲米样品的物性均偏酸，因此红曲米pH值（X1）的变异幅度较小。

表2 红曲米的特征指标Table2 The characteristic parameters of Hongqu

表3 描述性统计Table3 Descriptive statistics

2.2 指标间的相关性分析

各指标间的相关性分析见表4，左下角为相关系数，右上角为偏相关系数。从相关性来看，与产品酸度（Y）呈显著或极显著正相关的指标有容重（X3）和淀粉（X4），而偏相关系数并不显著，说明它们之间的正相关夹杂着其它变量混有的正效应；呈显著或极显著负相关的是红曲pH值（X1）和发酵力（X9）。从偏相关性来看，与产品酸度（Y）呈显著或极显著正相关的指标是液化力（X7），而呈显著或极显著负相关的是红曲pH值（X1）、蛋白质（X5）、发酵力（X9）和产酒力（X10）。综合相关性及偏相关性来看，对产品酸度（Y）均呈显著或极显著相关的指标是红曲 pH 值（X1）和发酵力（X9）。 红曲pH 值（X1）和液化力（X7）、总氨基酸（X6）和糖化力（X8）、液化力（X7）和发酵力（X9）之间的相关性及偏相关性也均呈显著或极显著正相关，这与唐玉明等[20]的研究认为泸州老窖成品曲酒化力与发酵醪酸度呈显著负相关一致。

表4 各指标间的相关性Table4 The correlation between the characteristic parameters

2.3 产品酸度的多元回归分析

为进一步解析各影响因子与酿造酸度间的关系，选取与产品酸度（y）相关性或偏相关性显著的因子红曲 pH（x1）、容重（x2）、淀粉（x3）、蛋白质（x4）、液化力（x5）、发酵力（x6）及产酒力（x7）进行多元逐步回归分析，得到方程：y=-206.6614+40.55114x1+8.9631x6+1.16790x7+0.1086x1x5-0.9471x1x6-0.2151x1x7-0.0002x2x3+0.0002x2x5+0.0244x3x5-0.0768x3x6+0.0264x4x5-0.1749x4x6+0.0233x5x6-0.0101x5x7（R=0.9894，P=0.0001），该方程可用于产品酸度的预测。各因子项的方差分析见表5，x2x5不显著，x1x5、x1x6、x2x3为显著项，其它 10 项均为极显著项，说明红曲 pH 值（x1）、发酵力（x6）、产酒力（x7）是影响产品酸度（y）的重要单因子，这与相关性分析结果相印证。

2.4 产品酸度的单因子回归分析

基于多元回归分析结果，选取红曲pH值、发酵力、产酒力分别与产品酸度进行单因子回归分析，结果见表6。产品酸度与3个影响因子的回归方程分别为：Y=285.218-118.540X+12.689X2、Y=13.214e-0.069X、Y=76.286e-0.011X，其中产品酸度与红曲pH值和发酵力的方程达极显著水平，与产酒力达显著水平。

表5 各因子项的方差分析Table5 Variance analysis of factors

表6 单因子与产品酸度的方差分析Table6 Variance analysis between the single factor and the product acidity

3 讨论与结论

1）酿酒红曲米主要以籼米为发酵基质，采用开放式培养制备工艺，因此含有复杂多样的微生物体系，如霉菌（红曲霉、黑曲霉、根霉等）、酵母菌、细菌（芽孢菌、乳酸菌和醋酸菌等）等[21-22]，是影响红曲米液化力、糖化力及发酵力等酿造特性的重要内在原因，这可从描述性统计分析得到验证，液化力、糖化力及发酵力等发酵特性指标的变异幅度大于50%，说明不同酿酒红曲米样品发酵特性各具地域特色。而红曲pH值、干燥失重、容重、淀粉、蛋白质、总氨基酸等表观特征指标及产酒力主要取决于发酵基质米的营养成分与添加使用量，因此其变异幅度不大。干燥失重与其它因子的相关性及偏相关性均不显著，可能是因为样品理化指标已换算为干基计。

2）综合相关性及偏相关性来看，均呈显著或极显著负相关的指标有：产品酸度与红曲pH值、产品酸度与发酵力；均呈显著或极显著正相关的指标有：红曲pH值和液化力、总氨基酸和糖化力、液化力和发酵力。现有研究认为，黄酒发酵醪酸败的根本原因是产酸微生物大量增殖[2-3]。酒曲酸度主要来源于产酸微生物代谢所产生的醋酸、乳酸和琥珀酸等[23]，红曲pH值低说明醋酸菌、乳酸菌等产酸菌活跃，反之则是酵母菌或霉菌等占优势。霉菌能直接利用生淀粉和粗蛋白[9]，霉菌菌群活跃则红曲米液化力提高，发酵基质糯米的淀粉、蛋白、粗纤维等不可溶性营养成分快速转化为可溶性的碳氮源[24]，进一步促进了酵母菌快速发酵并抑制杂菌，表现为前期发酵力显著提高，由此保证了产品较低的酸度，这与前人的研究结果一致[25]。因此，要获得较低酸度的红曲酿造产品，应选用弱酸性即pH略高的酿造红曲米，并采用适宜发酵工艺以提高红曲米的液化力及前期发酵速度。

3）剔除不显著项后，产品酸度（y）与红曲pH值（x1）、容重（x2）、淀粉（x3）、蛋白质（x4）、液化力（x5）、发酵力（x6）及产酒力（x7）的回归方程为：y=-206.6614+40.55114x1+8.9631x6+1.16790x7+0.1086x1x5-0.9471x1x6-0.2151x1x7-0.0002x2x3+0.0244x3x5-0.0768x3x6+0.0264x4x5-0.1749x4x6+0.0233x5x6-0.0101x5x7（R=0.9894，P=0.0001），该方程达极显著性水平，可用于预测红曲酿造产品酸度。产品酸度与红曲pH值、发酵力、产酒力的单因子模型均呈显著或极显著水平，都是影响产品酸度的重要因子。结合相关性分析来看，产酒力与产品酸度呈负相关，可能与红曲中酵母菌有关。本实验室前期研究结果表明[26]，当酵母菌通过EMP途径代谢及乙醇脱氢酶（ADH）作用下代谢生产越多的乙醇，其代谢副产物有机酸的产量越低。