陈 磊 Philip Haselberger 田 芳 蔡小堃 毛颖异 刘 爽 赵艳荣 王 硕* 关 岩*

（1 雅培营养品上海研发中心 上海 200233

2 雅培营养品 美国哥伦布 OH43219

3 南开大学医学院 天津 300350）

母乳寡聚糖（Human milk oligosaccharides，HMOs）是母乳中重要的营养物质与活性成分[1]。母乳寡聚糖不仅能抑制婴儿肠道内有害菌的粘附能力，提高婴儿免疫力[2]，还能促进肠道内益生菌的生长，改善胃肠道微生态[3-5]。母乳中的寡聚糖约有200多种，可定量分析的约有30多种[6-7]。HMOs按照单糖组成可分为3类：岩藻糖基化的中性HMOs，非岩藻糖基化的中性HMOs与唾液酸化的酸性HMOs。其中3-岩藻糖基乳糖（3-fucosyllactose，3-FL）与 2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）、乳糖-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LNnT）与乳糖-N-四糖（lacto-N-tetraose，LNT）、6’-唾液酸乳糖（6’-sialyllactose，6’-SL）与 3’-唾液酸乳糖（3’-sialyllactose，3’-SL）分别在3类HMOs中含量较高[8]，具有一定的代表性。唾液酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）是构成酸性HMOs的重要单糖衍生物，并且对于促进婴儿的大脑发育，提高婴儿认知能力具有重要作用[9-10]。因此，对于母乳中这6种母乳寡聚糖及唾液酸的快速定量分析具有重要意义。

目前，对于母乳寡聚糖的检测方法主要有高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）法[11-12]、液相色谱-质谱联用（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法[13-14]、核磁（Nuclear magnetic resonance，NMR）法[15]以及离子色谱（Ion chromatography，IC）法[8，16-17]。 采用HPLC法通常需对样品衍生后测定，操作繁琐且重复性较差。LC-MS法由于乳品复杂的基质导致回收率不理想，并且很难找到合适的内标消除误差。NMR法的样品需求量较大，并且灵敏度较差，不适用于母乳中寡聚糖的检测。近年来，IC法由于不需要样品的衍生在糖类检测方面有广泛应用，对于母乳寡聚糖的检测也多有报道。然而就目前报道的方法，仍有两个方面需要改善。首先，母乳寡聚糖种类繁多，采用IC法检测时容易产生相互干扰。此外，按照Lewis血型划分的分泌型与非分泌型妈妈产生的母乳中岩藻糖基化的HMOs组分含量差异明显[8，18]，并且各HMOs组分会随着泌乳期发生明显变化[12]。IC法中HMOs的分离度、量限与检测范围仍需进一步优化。母乳中唾液酸的检测方法主要有HPLC法[19]与LC-MS法[20]。HPLC法是通过将唾液酸与衍生试剂反应产生具有荧光性质的化合物进行检测。LC-MS法中样品经离心过滤后可直接检测。也有报道采用IC法[21]测定牛乳及乳制品中唾液酸的含量，然而还未应用于母乳中唾液酸的检测。同时检测母乳寡聚糖与游离唾液酸的方法国内外还未见报道。

本研究建立了采用离子色谱法，通过两种洗脱条件分离与测定母乳中6种主要母乳寡聚糖与游离唾液酸的方法，并在母乳基质中进行方法学验证。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

乳粉（34%蛋白，52%乳糖），市售产品；母乳样品：成熟乳基质样品、初乳样品1、过渡乳样品1、成熟乳样品1、初乳样品2、过渡乳样品2、成熟乳样品2，其中，3段乳样品1为分泌型，3段乳样品2为非分泌型，所有母乳样均从天津市南开医院收集获得。

质量分数50%的氢氧化钠溶液、乙酸钠，美国Sigma-Aldrich 公司；3-FL、2’-FL、LNnT、LNT、6’-SL 与 3’-SL，英国 Carbosynth 公司；Neu5Ac，加拿大Toronto Research Chemicals公司；试验用水为超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

Dionex ICS-5000离子色谱仪，美国Thermo Fisher公司，配有四元梯度泵、脉冲安培检测器、Chromeleon 6.8色谱工作站；Milli-Q Advantage A10超纯水仪，美国Millipore公司；Thermo REL5004V 冰箱、CarboPacTM PA1离子色谱柱（4 mm ×250 mm）、CarboPacTM PA1保护柱（4 mm ×50 mm），美国 Thermo Fisher公司；移液器（1 mL），德国 Eppendorf公司；尼龙滤膜（0.2 μm），英国Whatman公司。

1.3 标准溶液

按照表1中 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，Neu5Ac，6’-SL，3’-SL的质量浓度配制混合标准系列工作液。

表1 标准系列工作液中分析组分的质量浓度Table1 The mass concentration of each analyte in working standard solutions

1.4 离子色谱测定条件

CarboPacTMPA1离子色谱柱（4 mm×250 mm），CarboPacTMPA1保护柱（4 mm × 50 mm）；柱温25℃；检测器温度25℃；流量1 mL/min；进样量5 μL；淋洗液为水、500 mmol/L氢氧化钠溶液、300 mmol/L乙酸钠溶液；梯度洗脱程序1用于洗脱测试 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT（表2），梯度洗脱程序 2 用于洗脱测试 6’-SL，3’-SL，Neu5Ac（表3）。

1.5 样品处理

准确量取200 μL母乳样品于塑料离心管中，加入超纯水1 800 μL，混匀。然后放入4℃冰箱静置 10 min 后，用 Whatman 尼龙滤膜（0.2 μm）过滤得滤液，按照离子色谱测定条件进样分析6’-SL，3’-SL，Neu5Ac，滤液用超纯水稀释一倍后再次进样分析 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT。

1.6 统计学分析

采用SPSS V22.0进行数据处理与分析。独立样本T检验来评估两类样本间数据差异的显著性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 离子色谱法中梯度洗脱的选择

选择梯度洗脱条件时，比较了一次梯度洗脱测定与两种梯度洗脱程序分两次分析测定7种分析组分。一次梯度洗脱前期使用梯度洗脱程序1，至43 min时承接梯度洗脱程序2的条件。采用同一标准品溶液进样比较发现，一次梯度洗脱时，6’-SL与3’-SL的分离度为1.78，并且3’-SL谱峰有一定的拖尾，对称性较差（图1），而分2次梯度洗脱的分离度可以提高至1.83，并且谱峰没有产生拖尾现象，同时，Neu5Ac由于是重新采用较高洗脱能力的梯度洗脱，其保留时间较短，峰形较为尖锐，峰高是一次梯度洗脱的1.7倍（图1），因此可以达到更低的检出限和定量限。由于游离的Neu5Ac在母乳中含量很低[9]，尖锐的峰形更有利于Neu5Ac的检出与定量。

表2 梯度洗脱程序1Table2 Program of gradient elution 1

表3 梯度洗脱程序2Table3 Program of gradient elution 2

图1 不同洗脱程序的6’-SL、3’-SL、Neu5Ac离子流图Fig.1 Ion current chromatograms of 6’-SL，3’-SL and Neu5Ac with different elution programs

2.2 标准曲线线性范围

通过混合标准系列工作液做线性，各分析组分在设定的浓度范围内呈良好的线性关系（表4），相关系数均大于0.999，线性范围以mg/L母乳样品计。

表4 分析组分线性范围与标准曲线Table4 The linear range and standard curve of each analyte

2.3 检出限与定量限

由于母乳基质中各分析组分含量较高，不适用于定量限加标。因此选用各分析组分含量较低的乳粉作为基质，并调整基质中宏量营养素的含量得到乳粉基质溶液以匹配母乳基质（母乳中乳糖含量约6%，蛋白含量约1%[22]）。

在乳粉基质溶液中加标给定质量浓度的分析组分评估定量限，同时计算该溶液的3 s/n得出检出限。由表5可知，对于给定的加标量得到的回收率在92.6%～103.1%之间，相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）小于3.2%，该加标量可以作为方法的定量限，即 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，Neu5Ac，6’-SL，3’-SL的定量限分别为19.8，9.8，19.9，19.7，5.0，9.9，9.9 mg/L。从各分析组分得出 s/n 计算检出限（3 s/n）为5.2，0.4，2.8，2.5，0.5，1.0，1.8 mg/L。

表5 方法检出限与定量限的验证结果（n=6）Table5 Validation results of LOD and LOQ（n=6）

2.4 精密度与回收率

取成熟乳基质样品按照样品处理步骤处理后进样分析，测定6次后得出平均值，各组分RSD均小于3.7%。然后按照成熟乳基质样品中各组分质量浓度的50%与100%进行加标试验，评估方法的精密度与回收率。两组加标试验均做6次平行计算平均值，组分RSD均小于2.1%，回收率在91.8%～106.1%之间，说明该方法具有良好的精密度与回收率。

2.5 方法的应用

妈妈的Lewis血型决定了α-1-2-L-岩藻糖基转移酶是否正常表达分泌，而根据该酶的表达分泌状况可以将母乳分为分泌型与非分泌型，具体表现为分泌型母乳中含有大量的α-1-2-L-岩藻糖基化低聚糖，如2’-FL等，而非分泌型则较少[8，18]。另外研究显示母乳中各HMOs随着泌乳期会发生明显变化[12]。因此本文选择了分泌型与非分泌型的初乳、过渡乳、成熟乳共6个样品，采用该方法分别测定样品中 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，Neu5Ac，6’-SL，3’-SL的含量，每个样品做 3 个平行，用以考察方法在不同类型、不同阶段母乳中的适用性，测定结果如表7所示。

表6 方法精密度与回收率的验证结果（n=6）Table6 Validation results of precision and recovery（n=6）

表7 不同类别母乳样品中分析组分含量（n=3）Table7 The content of analytes in various human milk samples（n=3）

从表7中可以发现，分泌型3段乳中3-FL含量明显小于非分泌型 3段乳（P<0.05），而 2’-FL含量明显大于非分泌型3段乳（P<0.05）。所有样品中的游离的Neu5Ac质量浓度均低于30.9 mg/L。 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，Neu5Ac，6’-SL 与 3’-SL在这6种母乳样品中的最低浓度分别为42.3，24.7，74.4，493.8，10.0，98.2 mg/L 与 57.8 mg/L，均大于建立方法的定量限。对比已报道文献中这7种分析组分在母乳中的含量（表7）发现，由于该方法的定量限较低，个别样品中2’-FL与3-FL的含量低于文献中范围，其余的5种分析组分含量均在文献报道的范围内。并且所有已报道分析组分的检测值均高于本方法的定量限，且在线性范围内。因此该方法可满足母乳研究中主要HMOs与游离唾液酸含量的准确测定。

在目前可查的报道检测HMOs方法的文献中，HPLC法、LC-MS法以及 IC法报道较多[8，11-14，16-17]，其中 LC-MS 法与 IC 法均未对定量限进行验证，HPLC法中仅Sean等[11]建立的方法验证了定量限，方法中指出了3-FL与2’-FL的定量限分别为43 mg/kg与53 mg/kg，并发现哺乳期8个月内的母乳中有21%的样品中2’-FL无法定量测定，这部分样品均属于非分泌型母乳。由于非分泌型母乳中2’-FL含量较低，目前对于2’-FL的研究仅针对分泌型母乳。本文为进一步研究非分泌型母乳中2’-FL含量变化以及与其它HMOs的关系提供更为有效的方法。此外，2’-FL是划分分泌型与非分泌型母乳的一个重要指标，具有低定量限的方法能够覆盖更多低2’-FL含量的母乳样品的定量分析，为分泌型母乳与非分泌型母乳的具体划分提供更为有效的方法。同时，该HPLC方法指出了哺乳期8个月内的母乳中有2%的样品中3-FL含量低于定量限43 mg/kg，主要集中在分泌型母乳中。本研究建立的方法对更全面的研究母乳样品的3-FL的含量分布及在不同泌乳期的变化趋势提供可能。

另外，研究显示，成熟乳中 LNnT，LNT，6’-SL与3’-SL的含量与分泌型母乳中2’-FL含量会随着泌乳期迅速降低[23]。为研究泌乳后期母乳中LNnT，LNT，6’-SL，3’-SL 与 2’-FL 含量变化与相互关系，建立更为灵敏准确的定量方法也很有必要。与已报道的方法相比，本文建立的方法6’-SL，3’-SL 与 2’-FL 具有较低的定量限，同时样品制备的过程中不经稀释进样可以进一步降低LNnT，LNT与2’-FL的定量限，在检测研究泌乳后期母乳中 LNnT，LNT，6’-SL，3’-SL 与 2’-FL含量变化更有优势。

母乳中另一种活性成分唾液酸主要以糖键合、蛋白键合、脂质键合以及游离4种形式存在，游离的唾液酸占比较低，仅占总唾液酸的3%左右。试验发现哺乳期3个月内的母乳中游离状态的唾液酸含量为9.3～59 mg/L，并且其含量随着泌乳期会进一步降低[10]。对于报道采用HPLC、LCMS以及IC测定唾液酸的方法[19-21]中，并未进行方法的定量限验证。本文建立的方法对定量限进行了完整验证，能够准确定量母乳中含量较低的游离唾液酸，对于整个泌乳期母乳中游离唾液酸含量变化的研究提供一个有效的方法。

3 结论

采用离子色谱建立了测定母乳中3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，6’-SL，3’-SL 6 种主要 HMOs 以及游离唾液酸的方法，该方法操作简单，具有良好的分离度、精密度与准确性以及较低的检出限与定量限，研究证明对于分泌型与非分泌型3段乳中的这7种组分均能够准确定量。该方法可以应用于母乳研究中主要HMOs与游离唾液酸的常规检测与分析。