韦锦梅　陆梅元　韦秀梅　丘琴　黄凤音　陈科成　甄汉深

摘要：采用超声提取法提取罗汉松[Podocarpus macrophyllus （Thunb.） D. Don]茎中的总黄酮，通过单因素试验方法考察了提取方法、提取溶剂体积分数、提取溶剂体积、提取时间对总黄酮含量的影响，采用正交试验优化提取工艺条件，筛选出罗汉松茎中总黄酮的最佳提取工艺。结果表明，最佳提取工艺为70%乙醇、超声提取1.0 h、料液比1∶20（m/V）。超声提取法提取罗汉松茎中总黄酮含量，该方法重复性较好、稳定、可行。

关键词：罗汉松[Podocarpus macrophyllus （Thunb.） D. Don];茎;总黄酮;提取工艺

中图分类号：R282.2         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）18-0098-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.18.024           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of extraction technology and content determination of total flavonoids from Podocarpus macrophyllus （Thunb.） D. Don

WEI Jin-mei1，LU Mei-yuan2，WEI Xiu-mei3，QIU Qin1，HUANG Feng-yin1，CHEN Ke-cheng1，ZHEN Han-shen1

（1.School of Pharmaceutical Sciences，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China;2.Guangxi Food and Drug Evaluation and Inspection Center，Nanning 530200，China;3.Liuzhou Traditional Chinese Medicine Hospital，Liuzhou 545001，Guangxi，China）

Abstract： The total flavonoids of the stem of Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don was extracted by ultrasonic extraction， and the effects of extraction methods， solvent concentration， extraction sdvent volume and extraction time on total flavonoids were investigated by single factor test. Orthogonal experiment was used to optimize the extraction process and select the best extraction process of total flavonoids from the stem of Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don. The results showed that the best extraction technology was 70% ethanol， ultrasonic extraction of 1.0 h， and the ratio of material to liquid 1∶20（m/V）. The ultrasonic extraction method can be used to  extract the total flavonoids of the stem of Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don. The method has good reproducibility， stability and feasibility.

Key words： Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don; stem; total flavonoids; extraction technology

罗汉松[Podocarpus macrophyllus （Thunb.） D. Don]又名土杉，短叶土杉，是罗汉松科罗汉松属植物，主要分布在中国的广西、广东、湖南、贵州、江苏、浙江、福建等地[1]，在广西北海已经大规模种植罗汉松。据《中药志》记载，罗汉松性平、味淡，具有黄酮类、挥发油、萜类化合物等成分，临床上具有补中益气、祛风除湿、凉血止血的功效，用于治疗关节肿痛、心胃气痛、咳血吐血等病症[2]。现代科学研究表明，植物中广泛存在的黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、降血脂、抗病原微生物活性、改善心肌供血和抗抑郁等作用[3-8]，还具有抗肿瘤、抗心血管疾病、糖尿病、抗感染和抗病毒等药理作用[9-14]。此外，罗汉松内生的真菌对寄主植物的病虫害具有一定的防御作用[15]。

目前，国内外鲜见对罗汉松茎中总黄酮含量测定的相关研究，為保证其药材质量及临床疗效，本试验建立了罗汉松茎中总黄酮含量的测定方法，为建立罗汉松科学、合理、可控的质量标准提供科学依据。生物总黄酮是药用价值较高的天然资源，中国拥有丰富的生物总黄酮资源，测定罗汉松茎中总黄酮的含量，并比较广西不同产地罗汉松茎中总黄酮的含量差异，以完善罗汉松药材的质量标准。

本研究以罗汉松茎中的总黄酮含量为指标，采用单因素试验考察了提取方法、提取溶剂体积分数、提取溶剂体积、提取时间对提取药材中总黄酮含量的影响，再采用正交试验进一步优选最佳提取工艺，为研究罗汉松提供参考依据。同时对广西境内6批不同产地的罗汉松茎总黄酮含量进行测定，为罗汉松药材的质量评价提供参考，也为研究罗汉松药材的质量控制新方法奠定一定的基础。

1  材料与方法

1.1  仪器

UV1780型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）;法国默克密理博纯水仪;XS105D十万分之一天平（梅特勒-托利多称重设备系统有限公司）;DFT-1000高速万能打粉机（温岭市林大机械有限公司）;KQ5200B超聲波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2  试药

芦丁（批号：170224），纯度>98%，购于上海融禾医药科技有限公司;其余试剂均为分析纯。药材来源见表1，经广西一心医药集团有限责任公司马利飞中药师鉴定为罗汉松，经60 ℃烘干，备用。

1.3  方法与结果

1.3.1  对照品溶液的配制  精密称取干燥至恒重的芦丁对照品适量，置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶液溶解，定容至刻度，振荡摇匀，配成0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液。

1.3.2  样品溶液制备  取药材粉末1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，加70%乙醇20 mL称定重量，超声提取1.0 h，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取过滤液1 mL置于25 mL容量瓶中，即得样品溶液。

1.3.3  标准曲线的制定  精密称取120 ℃干燥恒重的芦丁对照品5 mg，加70%乙醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，摇匀，制成浓度为0.2 mg/mL的标准品溶液。分别取标准品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸铝0.4 mL，放置6 min，再加4%氢氧化钠4.0 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，然后在波长508 nm处测定吸光度。得到直线方程为y=11.164x-0.011 3，R2=0.999 1，在0.01～0.08 mg/mL范围内，浓度与吸光度有良好的线性关系，芦丁标准曲线见图1。

1.3.4  方法学考察

1）精密度试验。精密称取广西那坡县产的罗汉松药材粉末1.0 g，按“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按标准曲线的制定方法进行显色测定。于波长508 nm处连续测定6次吸光度，结果RSD为1.63%，该方法精密度良好。

2）重复性试验。精密称取广西那坡县产的罗汉松药材样品6份，每份药材粉末1.0 g，按“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按标准曲线的制定方法进行显色测定。于波长508 nm处平行测定其吸光度，计算药材的平均含量为23.16 mg/g，RSD为2.26%，表明该方法重复性良好。

3）稳定性试验。精密称取广西那坡县产的罗汉松药材粉末1.0 g，按“1.3.2”操作步骤制备供试品，按标准曲线的制定方法进行显色测定。于508 nm波长处分别在0、10、20、30、40、50、60 min测定吸光度，计算药材的RSD为2.08%，结果表明，吸收度在60 min内基本不变，可见样品在60 min内稳定。

4）加样回收率试验。称取罗汉松药材粉末6份，每份0.5 g，精密称定，加入芦丁对照品11.58 mg，按“1.3.2”操作步骤制备供试品，按标准曲线的制定方法进行显色测定。于波长508 nm处平行测定其吸光度，计算总黄酮的含量。平均回收率为98.96%，RSD为2.65%（n=6），该方法回收率良好。

1.4  单因素试验

1.4.1  提取方法选择  取药材粉末1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，以提取时间1.0 h、20 mL 70%乙醇为提取条件，分别采用回流提取法、超声提取法和溶剂浸渍法对药材总黄酮进行提取，按“1.3.2”操作步骤制备供试品，按标准曲线的制定方法进行显色测定。结果显示，超声提取与回流提取的提取率都比溶剂浸渍法的提取率高，且超声提取与回流提取的提取率基本无差异，考虑到操作方便与节能，选择超声提取方法。

1.4.2  乙醇溶剂体积分数选择  取药材粉末1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，以提取时间1.0 h、20 mL不同体积分数乙醇溶剂为提取条件，设计乙醇体积分数分别为30%、50%、60%、70%、80%和95%，采用超声提取法测定药材总黄酮得率。

1.4.3  乙醇溶剂提取体积选择  取药材粉末1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，以提取时间1.0 h、70%乙醇为提取条件，采用超声提取法，取不同体积70%乙醇10、20、30、40、50、60 mL进行单因素试验，测定药材总黄酮得率。

1.4.4  提取时间选择  取药材粉末1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，以70%乙醇30 mL为提取条件，采用超声提取法，以提取时间对药材总黄酮得率进行单因素试验，设提取时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，测定药材总黄酮得率。

1.5  正交试验

从罗汉松茎中提取总黄酮的方法主要包括有机溶剂提取法、浸渍法[16，17]。参考《中国药典》2015年版相关方法，选择乙醇为溶剂的提取方法，考察了乙醇体积分数（60%、70%、80%）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40）（质量∶体积，下同）、提取时间（1.0、1.5、2.0 h）3个条件，选用L9（34）正交试验设计（表2）。

精密称取罗汉松药材粉末1.0 g，精密称定，按照上述罗汉松茎中总黄酮的提取方法进行提取，再按L9（34）正交试验方案，使用紫外-可见分光光度计对罗汉松茎中总黄酮含量进行测定。

2  结果与分析

2.1  单因素试验结果

不同乙醇溶剂体积分数单因素试验结果显示，采用70%乙醇超声提取，罗汉松茎中总黄酮得率为2.19%，含量最高，达到21.94 mg/g;不同乙醇溶剂提取体积单因素试验结果表明，当乙醇溶液提取体积为30 mL时罗汉松茎中总黄酮得率2.35%，含量最高，达到23.53 mg/g;不同提取时间单因素试验结果表明，提取时间为1.0 h时，罗汉松茎中总黄酮得率为2.17%，含量最高，达到21.66 mg/g。

2.2  正交试验结果

根据正交设计，试验方差分析结果可知，以罗汉松茎中总黄酮含量为试验指标，各试验因素对罗汉松总黄酮提取效果的影响程度不同。直观分析结果（表3）表明，乙醇体积分数和料液比对总黄酮的提取工艺有明显影响，其次是提取时间;方差分析结果（表4）表明，乙醇体积分数和料液比对罗汉松茎中总黄酮提取有显著影响，而提取时间无显著影响，且各因素影响的强弱为A>B>C，考虑试验效率和时间，选择提取时间为1.0 h，因此最理想的提取方案是A2B1C1，即乙醇体积分数70%，料液比1∶20，超声提取时间1.0 h，此时提取效果最佳。

2.3  样品含量测定

精密称取罗汉松药材茎部粉末3份，每份1.0 g，置于锥形瓶中，按“1.3.2”操作步骤制备供试品，按标准曲线的制定方法进行显色测定，使用紫外-可见分光光度计测定其总黄酮含量，结果见表5。结果表明，广西合浦县、南宁市产的罗汉松总黄酮含量较高，分别达到25.57、24.18 mg/g，是较好的用于提取总黄酮的药材。

3  讨论

以中药罗汉松茎为研究对象，考察了乙醇体积分数、料液比和提取时间3个影响因素，采用超声提取法来提取罗汉松茎中总黄酮，利用L9（34）正交试验的方法来优选出罗汉松茎中总黄酮的最佳提取工艺。结果表明，超声法提取罗汉松茎中总黄酮的最佳工艺为乙醇体积分数70%，料液比1∶20，提取时间1.0 h，此提取效果最佳，为优化超声法提取罗汉松茎中总黄酮的工艺提供了参考依据。

在相同试验条件下，加入等量同体积分数的乙醇可能会出现提取效率不一致的状况。具体原因可能是罗汉松的茎接触乙醇溶剂的面积不一样。但是在加入相同质量的罗汉松茎的情况下，加入乙醇的量越多，对提取的效率有正向影响。除此之外，还可以考察更多的试验因素，如提取温度、溶剂pH和提取次数等，并且每个因素也可以通过单因素考察法确定出试验水平范围，再通过正交设计试验优选出提取工艺。

用超声法提取罗汉松茎中的总黄酮，适宜的超声提取条件可以提高总黄酮的得率。由于超声波的空化作用、机械作用和热效应等共同的作用下，罗汉松茎中总黄酮的溶出速度加快，提高了提取效率。

广西不同产地罗汉松茎中总黄酮含量差异较大，广西合浦县的罗汉松茎中总黄酮含量最高，其次是广西南宁市，而广西全州县和广西百色市的罗汉松茎中总黄酮含量较低。罗汉松自然资源丰富，在临床应用中广泛使用，對罗汉松茎中有效成分的开发有待加强。

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