尚小红/严华兵/曹 升/肖 亮 广西壮族自治区农业科学院经济作物研究所,广西 南宁 530007

尚小红/王 艳/欧昆鹏 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室,广西 南宁 530007

晋 玲 甘肃中医药大学药学院，兰州730000

葛根(Pueraria DC.)为豆科多年生植物,是国家卫生部首批公布的药食同源植物,享有“北参南葛”、“亚洲人参”的美誉[1]。 葛根含有葛根素、黄酮、多糖等多种药用成分,具有生津止渴、解表退热、止泻等功效[2],且具有维护心血管系统、抗癌、降血糖等多种药理活性[3]。 此外,葛根还富含淀粉,可作为非粮生物质新能源,具有巨大的开发潜力。 葛根是广西传统种植的农作物,种质资源丰富且具有一定的种植规模。其中,广西梧州市藤县和平镇是中国著名的“葛根之乡”,目前葛根种植面积占全国的20%,是当地农民的主要经济收入来源和增收渠道[4-5]。 同时,广西野生葛根资源在各市县均有广泛分布,但因过度采挖导致流失严重。 因此,开展广西葛根种质资源收集、遗传多样性评价及利用,对于推动葛根产业的可持续发展具有重要意义。

目前,葛根种质资源的遗传多样性分析大多采用田间形态指标,如叶形、叶长、叶宽、叶花纹、叶面皱纹、叶柄色、叶柄粗、节间长、茎长、茎粗、分枝数、茎皮色、块根形状等进行鉴定评价[6-8],但其易受到环境、主观判断等因素的影响,导致鉴定评价结果并不准确,而分子标记鉴定具有快速、准确等优点。近年来,随机扩增多态 性( random amplified polymorphic, RAPD )标记[9-11]、内 部 简单 重 复 序 列 ( inter-simple sequence repeat, ISSR)标 记[12-13]、 相 关 序 列 扩 增 多 态 性 (sequencerelated amplified polymorphism, SRAP ) 标记[14]等技术已应用于葛根遗传多样性方面的研究,但目前尚未有针对广西地方品种的相关报道。

目标起始密码子多态性标记(start condon targetedpolymorphism,SCoT)是首先在水稻上提出的,是以植物基因中的 ATG 翻译起始位点侧翼序列的保守性设计单引物并对基因组进行扩增,扩增产物用简单的琼脂糖分离检测的目标分子标记新技术[15]。 SCoT 分子标记具有操作简单、通用性强、成本低廉、多态性丰富等优点[16],目前已广泛应用在桃儿七[17]、葡萄[18]、芒果[19]、土豆[20]、枸杞[21]、龙眼[22] 、菠萝[23]、兰[24]、柑橘[25]、柳枝稷[26]、铁皮石斛[27]、菊花[28-29]、南瓜[30]、木薯[31]等多种作物的遗传多样性分析、差异表达基因筛选[32-34]等分子生物学研究中,但在葛根遗传多样性分析上尚无相关研究报道。 本研究收集了分布于广西各地的葛根共 44 份种质资源,应用 SCoT 分子标记技术对其进行遗传多样性及亲缘关系的分析,以期为广西葛根种质资源的鉴定评价、利用及进一步加快广西葛根品种改良及选育提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

表 1 供试葛根材料及来源Table 1 Tested Pueraria materials and their origins

本研究所用的试验材料共计 44 份葛根种质资源(详见表1),收集自广西河池、百色、桂林、贺州、玉林、梧州、来宾、南宁、防城港和柳州等地,包括5个栽培品种和39个野生品种,种植于广西农业科学院里建科学研究基地及广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所育种基地。SCoT引物参照文献[15],由上海生工生物工程股份有限公司合成(表 2)。 植物基因组 DNA提取试剂盒、DL M2000、琼脂糖、核酸染料 GelRed、ExTaq DNA聚合酶、50×TAE buffer 等均购自宝生物工程(大连)有限公司。

表2 25条 SCoT 引物的扩增结果及多态性信息Table 2 Amplification results and polymorphism information of 25 SCoT primes

1.2 试验方法

1.2.1 基因组 DNA 的提取与检测于 2017 年5 月采集每份葛根种质资源的 3～5 个无病虫害单株生长顶端的幼嫩叶片,置于写好编号的自封袋后放置于冰盒,带回广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室,-40℃保存备用。 混合叶片并用液氮研磨成粉末后,按照植物基因组 DNA提取试剂盒(TaKaRa,日本)说明书提取各材料的基因组DNA。 用 1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度及完整性,并用UV-2700紫外分光光度计(日本岛津)检测其浓度,稀释成终浓度为50ng●μL-1,-40℃保存备用。

1.2.2 引物筛选从供试材料中选取 4 份形态学差异较大的样品DNA,对36条SCoT 引物进行筛选,最终确定稳定性、多态性好且带型清晰的 25条引物用于所 DNA 扩增。

1.2.3 SCoT-PCR扩增与检测 葛根 SCoTPCR扩增体系为20μL,包括 DNA 50ng,dNTPs 0. 25 mmol●L-1,Mg2+1. 5 mmol●L-1,引物 0. 8 μmol●L-1,Taq DNA 聚合酶 0. 5 U,ddH 2 O 补足至 20 μL。 扩增程序 :94℃ 预变性 4 min;94℃变性 30 s,50℃退火 1 min,72℃延伸 90s,35 个循环;72℃ 终延伸 5 min,4℃ 保存。 反应结束后,取6μL PCR 产物 ,与 1μL 6×Loading buffer 混匀后用含有 GelRed 核酸染色剂的 1%琼脂糖凝胶进行电泳分离,缓冲液为 1×TAE,在 110 Ⅴ恒电压下电泳约25 min。 电泳结束后利用紫外凝胶成像系统拍照保存。

1.2.4 数据统计与分析根据44份葛根种质资源SCoT-PCR 扩增产物的电泳图,按同一分子量大小的DNA 条带的有无进行数据统计,有条带记为“1”,无条带记为“0”,构建 44 份材料的分子标记结果的数据矩阵。 利用 NTSYS-pc2. 10e 软件计算遗传相似系数,并进行聚类分析,构建树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 SCoT标记的多态性分析

利用 25 条 SCoT 引物对 44 份葛根种质资源的DNA 进行 PCR 扩增,产物分布在 200～3000 bp 之间,共扩增出 223 条清晰的条带,每条引物扩增出的条带数在 3～15 之间,平均每条引物能扩增出 8. 92 条。 多态性条带合计 194 条,平均每条引物扩增出 7. 76 条差异性条带,多态性比率高达86. 99%。 其 中 ,SC2、SC4、SC5、SC12、SC13和 SC21 这 6 条引物扩增出的多态性条带比率达到100%,引物 SC35 扩增产物的多态性比率最低,为50%(表 2)。 扩增结果表明,利用 SCoT 标记对葛根种质资源进行扩增,产物表现出条带丰富、背景清晰干净、重复性好且多态性高的特点(图 1)。

2.2 相似性分析

图1 引物 SC22 的 SCoT-PCR 扩增结果Fig.1 SCoT-PCR amplification by primer SC22

将 25 个引物对 44 份葛根材料扩增的条带对应的原始数据矩阵导入 NTSYS-pc2. 10e 软件中,计算出各材料之间的遗传相似系数,所有葛根供试材料之间的遗传相似系数范围在 0. 587～0. 982之间。 25 号与 26号材料的相似系数最高,为 0.982,二者与 24 号材料的相似系数均为 0. 973,三者均为来自广西百色老山的材料;其次为 28 号与29 号材料,二者的相似系数高达 0. 973,二者与 27号材料的相似系数均为 0. 946,三者均为来自桂林会仙的材料,同时,27 号材料与来自桂林平乐的 30号材料相似系数高达 0. 955;来自广西百色田林的7 号与 8 号材料,相似系数为 0. 951;来自梧州藤县的 10 号材料与来自桂林阳朔的 11 号材料,相似系数为 0. 946。 14 号与 37 号材料的遗传相似系数最低,仅为 0. 587,表明二者亲缘关系最远;37号与4 号材料的遗传相似系数为 0. 601;37 号与 12号材料的遗传相似系数为 0. 605。

2.3 聚类分析

由图 2 可知,在遗传相似系数为 0. 65 水平时,可将 44 份葛根材料分为两大类,第一类只包含一个材料,即 37 号材料,其他 43 份材料归为一类。在遗传相似系数为 0. 74 水平时,可将第二大类的43 份葛根材料分为 5 个亚组,其中,第Ⅰ亚组包含了 32 份材料,占所有种质资源的 72. 7%;第Ⅱ亚组包含 2 号、4 号、20号、6 号和 9 号共 5 份材料;第Ⅲ亚组包含 35 号、36 号和 39 号共 3 份材料;第Ⅳ亚组包括 21 号和 22 号共 2份材料;第Ⅴ组只有 14 号 1 份材料。 综上,通过 SCoT标记技术可以将 44 份广西葛根种质资源完全区分。

3 讨论

种质资源是进行品种选育的材料基础,遗传多样性的高低决定了物种的基因丰富程度。 分子标记技术能快速、准确地对种质资源遗传多样性进行分析 [21] 。SCoT 分子标记技术为通用型引物,适用于各种作物,如多态性条带比率在葡萄中高达 93. 1% [18] ,在菊科作物中高达 90. 43% [27],在柳枝稷中达到 90. 3% [26] ,多态性条带比率在柑橘中最低,为 54. 8% [25] 。 周精华等 [11] 利用 RAPD 技术对来自湖南和江西的 8 份葛根种质资源进行亲缘关系分析,平均多态性比率为65.65%;景戌等 [9] 利用 RAPD 标记对 12 份重庆地区的葛根进行了遗传多样性分析,平均多态性比率为64. 41%;郭艳艳等 [12] 利用 ISSR 标记对来自广西、云南、江西和湖北 4 个地区的 11 份葛根种质资源进行了多态性及聚类分析,平均多态性比率为 63. 9%;陈大霞等 [14] 利用 SRAP 标记对 18 个粉葛栽培种进行遗传多样性分析,平均多态性比率为 63. 9%。 本研究采用 25 条 SCoT 引物对 44 份广西葛根种质资源进行遗传多样性分析,检测出了丰富的差异条带,平均多态性比率高达 86. 99%。本研究采用 SCoT 技术所获得的多态性比率高于利用 RAPD、ISSR 和 SRAP 分子标记技术进行检测的结果,说明 SCoT 标记对葛根种质资源具有较高的鉴别能力,可进一步应用于葛根遗传多样性分析、分子标记辅助育种等研究。

本研究中 44 份供试葛根材料来自广西不同区域,SCoT 聚类结果表明,葛根种质资源的亲缘关系与其来源地具有一定的相关性,但并不完全相关。 如来自河池的 1 号与 3 号材料,来自百色田林的 7 号与 8 号材料,来自百色老山的 24 号、25号和 26 号材料,来自桂林会仙的 27 号、28 号、29号和 30 号材料,分别聚类在一起。 但来自同一地域的材料,如来自河池的 1 号、36号和 37 号材料,来自桂林的 4 号和 16 号材料,均未聚类在一起,而来自不同地域的材料,如梧州藤县的 10号材料和桂林阳朔的 11 号材料相似度较高,反而聚类在一起,表明广西葛根材料具有一定的丰富度,但不同地域的葛根材料可能存在相互引进及交流的现象。 这与前人研究结果 [12,14] 一致。 本研究中,5份栽培葛根材料(10 号、13 号、18 号、38 号和40 号)全部聚类到第一大类的第Ⅰ亚组,其遗传相似系数介于 0. 74 ～0. 89 之间,可能是由于长期驯化和定向选择导致其遗传背景较为接近。 同时还发现栽培葛根与野生葛根资源聚类相互交叉,这与袁灿等 [13] 的研究结果一致。 其中,栽培种 10号、13 号、18 号和 40 号材料分别与野生种 11号、12 号、27 号和 41 号材料的遗传相似系数均达到 0. 90 以上,其原因可能是因为栽培葛根是从这些野生葛根资源的优良材料中选育而成。 37 号材料单独聚到一类,与其他种质资源均有较大的遗传差异,田间表型鉴定发现该种质资源的叶片为墨绿色,且完全无毛,与其他种质资源的差异性较大,可进一步通过表型鉴定挖掘其在其他方面的特性,开发与葛根相关性状关联的分子标记等。 此外,广西葛根种质间遗传相似度较高,大部分均达到 0.72 以上,说明其遗传基础较为狭窄,需要进一步加大种质资源引种力度,广泛引进区内外葛根种质资源及创制新种质,丰富种质资源的多样性,为培育优良葛根品种奠定基础。

图2 44份葛根材料的 SCoT 分子聚类图Fig.2 Dendrogram of 44 Pueraria accessions by SCoT molecular markers

4 结论

本研究利用 25 条 SCoT 引物对 44 份广西葛根材料的基因组 DNA 进行 PCR 扩增,平均每条引物获得7. 76 个多态性条带,多态性比例为 86.99%。 聚类分析结果表明,44 份葛根种质资源的遗传相似系数介于0. 587～0. 982 之间。 在系数为 0.65 处,44 份葛根分为两大类,37 号材料单独成为一类;在系数为 0. 74处,可聚为六类,表明 SCoT分子标记适用于葛根种质资源遗传多样性分析。本研究结果为广西葛根种质资源鉴定评价和新品种选育奠定了一定的理论基础。