唐阳，周页，吴珊，王洁雪

（成都师范学院 化学与生命科学学院功能分子研究所，四川成都 611130）

高良姜为姜科山姜属植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的干燥根茎[1]，分布在我国的广东、贵州、福建、海南、云南、广西和四川等地，别称蜜姜、南姜、小良姜、良姜等。高良姜性热味辛，具有消食、止痛、温中散寒之功效[2]，是治疗冷肠泄泻、反胃吐食、胃寒少食等症状的良好药材[3]。高良姜含有多种化学成分，其中黄酮类成分高良姜素（Galangin，3,5,7-三羟基黄酮）是高良姜药材的主要药效成分，同时也是该药材的质量控制成分[4-6]。由于高良姜素能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，且毒性较低，是一种具有良好开发前景的天然化学预防药物，已成为国内医药界研究与开发的热点[7]。

本文以高良姜素为对照品，采用高效液相色谱法[8-9]，通过单因素实验结合响应面法优化高良姜中高良姜素的最佳提取工艺，为进一步开发高良姜药材提供有用的数据和可靠的技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters2695高效液相色谱仪、AUW120D电子分析天平、ULTRASONIC CLEANER超声仪、NAIZFCDY-6索氏提取器、HU-ZK4电热恒温水浴锅。

高良姜药材，购自成都市荷花池中药材市场；高良姜素对照品（HPLC=98.31%，成都康邦生物科技有限公司生产），乙腈为色谱纯，磷酸为优级纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件

色谱柱：SHIMADZU shim-pack GISS C18（4.6×250 mm 5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：265 nm；进样量：10 μL。

1.3 高良姜素标准曲线的绘制

精密称取高良姜素对照品10.34 mg，置于10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制得1.034 mg/mL高良姜素对照品贮备液。分别取高良姜素对照溶液4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL和14 μL进样分析，以峰面积（Y）为纵坐标、进样体积（X）为横坐标进行线性回归，得到高良姜素的回归方程为Y=4 590 999X+8 770 984，R2=0.999 7。表明高良姜素在4.136～14.476 μg范围内呈良好的线性关系。

1.4 样品溶液的制备

精密称取高良姜药材1.0 g，干燥后粉碎过40目筛，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液，在相应温度下超声提取规定时间，离心，定容至10 mL，得样品溶液。高良姜提取液经0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液10 μL进行高效液相色谱分析，并根据峰面积计算高良姜素得率。计算公式：高良姜素得率（mg/g）=提取得到的高良姜素质量（mg）/高良姜药材质量（g）。

以高良姜素含量为评价指标，分别考察不同提取时间、提取次数、料液比、乙醇浓度对高良姜中高良姜素含量的影响。依据单因素实验结果确定因素水平范围，利用Design Expert Software 软件辅助手段设计响应面试验。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 超声时间对高良姜素得率的影响

固定料液比1∶8，乙醇浓度为90%，超声温度50 ℃，超声提取2次，考察不同超声提取时间对高良姜素提取率的影响。结果如图1显示，从10～30 min提取率随提取时间的延长而增加，在25 min时达最大值0.90，再延长超声时间，提取率趋于平稳，略有下降。因此，选择超声时间在25 min左右适宜。

2.1.2 提取次数对高良姜素得率的影响

固定料液比1∶8，乙醇浓度为90%，超声温度50 ℃，提取25 min，考察不同提取次数对高良姜素提取率的影响。图2结果表明，随着提取次数增加，提取率升高，在3次后提取率增加不明显，增幅为2%。综合实验工作量及提取率，选择提取次数在2次左右适宜。

2.1.3 料液比对高良姜素得率的影响

固定乙醇浓度为90%，超声温度50 ℃，提取25 min，提取2次，按照料液比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和1∶12加入提取溶剂，考察不同料液比对高良姜素提取率的影响。图3结果表明，1∶8的料液比达到最大的提取率0.97，再增大料液比，高良姜素得率反而下降，可能的原因随着料液比的增大，其他物质的溶出增加。因此，料液比为1∶8左右为宜。

2.1.4 乙醇浓度对高良姜素得率的影响

固定料液比为1∶8，超声温度50 ℃，提取25 min，提取2次，考察不同乙醇浓度对高良姜素提取率的影响。图4结果表明，80%～100%乙醇浓度范围内，高良姜素提取率随乙醇浓度增加而升高，原因可能是高良姜素化合物极性较低的原因。因此，选择提取乙醇为无水乙醇。

2.2 响应面法优化高良姜素提取条件

2.2.1 响应面优化实验

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken中心试验设计，以对高良姜素得率影响最大的几个因素为自变量，以高良姜素得率（Y）为响应值进行响应面试验。响应面的因素与水平设计见表1，结果见表2

图1 提取时间对高良姜素得率的影响

图2 提取次数对高良姜素得率的影响

图3 料液比对高良姜素得率的影响

图4 乙醇浓度对高良姜素得率的影响

表1 响应面的因素与水平设计

表2 响应面优化实验结果

2.2.2 回归方程的建立与方差分析

利用 Design -Expert 软件对表2数据进行分析，得到二次多项式回归方程，高良姜素得率Y=+0.91+0.0025A-0.059B+0.056C-0.001AB+0.005AC-0.082BC-0.058A2-0.010B2+0.050C2，该多元回归模型的方差分析及显著性检验结果见表3。

由表3可知，回归项P=0.002 6＜0.01，回归模型极显著，在统计学上有意义。失拟项用来表示所用模型与实验拟合的程度，即二者差异的程度。失拟项P=0.326 8＞0.05，影响不显著，说明模型拟合度很好。因此，能够使用该回归模型对试验数据进行分析，优化高良姜中高良姜素的提取工艺参数。各因素对高良姜素得率的影响次序为：料液比＞乙醇浓度＞提取时间。

为了观察某个因素及其交互作用同时对高良姜素得率的影响，将其他因素保持条件不变，获得每个因素及其交互作用对高良姜素得率影响的一组动态响应曲面图（图5～7），从而确定因素的最佳参数范围。

图5 提取时间与料液比交互作用对高良姜素得率的影响

表3 回归方程中系数的显著性检验

图6 提取时间与乙醇浓度交互作用对高良姜素得率的影响

图7 料液比与乙醇浓度交互作用对高良姜素得率的影响

由图5可以看出，固定料液比、增加提取时间有利于提高高良姜素得率，继续增加提取时间，高良姜素得率反而下降。由图6可以看出，固定提取时间，增大乙醇浓度有利于提高高良姜素得率。由图7可以看出，料液比与乙醇浓度交互作用曲面最陡峭，说明两者交互作用对高良姜素得率影响最为显著。固定乙醇浓度，减小料液比有利于提高高良姜素得率。

2.3 优化工艺的验证

通过Design -Expert软件方程求解，以高良姜素得率为响应值，根据响应面分析得到最佳提取高良姜素的工艺为：料液比为1∶6的无水乙醇超声提取2次，每次25 min，高良姜素得率为1.15%。为验证响应面分析法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行3次平行试验。实际测得的高良姜素得率的平均值为1.13%。结果说明预测值与实际值之间有很好的拟合性，进一步验证了该模型的可行性。

3 结论

本实验采用HPLC作为纯化指标检测方法，通过单因素试验考察提取时间、提取次数、料液比、乙醇浓度对高良姜素得率的影响，进一步通过响应面法分析各因素交互作用对高良姜素得率的影响，优化得到提取高良姜素的最佳工艺，料液比为1∶6的无水乙醇超声提取2次，每次25 min，高良姜素得率的平均值为1.13%。优化的提取工艺操作简便，且设备要求不高，提取使用的溶剂对环境无污染，使用的乙醇可回收蒸馏后重复使用，故提取成本较低，在后续工作中，按照此提取工艺大量制备高良姜素，以此开展相关的活性测试研究。