张少钦 路秋萍 周正

摘要：目的  建立以煤焦瀝青（CTP）烟提取物灌胃诱发雌性KM小鼠肺癌的动物模型，并以雌二醇（E2）为代表，研究雌激素在该CTP致小鼠肺癌模型过程中的作用。方法  将260只5周龄清洁级雌性KM小鼠按随机原则分为9组，分别为CTP组（27只）、CTP+E2组（28只）、CTP+TAM组（29只）、CTP+E2+TAM组（28只）、E2组（34只）、TAM组（30只）、E2+TAM组（29只）、溶剂对照组（27只）、空白对照组（28只），每组分别给予不同的染毒处理，观察并记录小鼠的生长、活动、饮食和健康状况，并称量体重。染毒后10周处死，收集各组肺组织，HE染色后，显微镜观察组织病理变化情况;观察肿瘤发生数，计算肺癌发生率。结果  CTP+E2+TAM组小鼠肺癌发病率为32.14%，其肺癌发病率和肿瘤数均低于CTP+E2组，差异无统计学意义（P>0.05）;CTP组小鼠肺癌发病率为26.92%，其肺癌发病率和肿瘤数均高于溶剂对照组和空白对照组（P<0.05）;CTP+E2组的肺癌发病率最高，为57.14%，其肺癌发病率和肿瘤数均高于对照组和单纯E2组（P<0.05）;肿瘤结节HE染色确诊的肿瘤均为腺瘤，与正常肺组织分界清楚。肿瘤组织呈腺样排列，主要位于核膜下。结论  建立了CTP烟提取物诱发雌性KM小鼠肺癌的动物模型，E2能够促进CTP烟提取物诱发的小鼠肺癌。

关键词：煤焦沥青烟;雌激素;肺癌

Abstract：Objective  An animal model of female KM mice lung cancer induced by coal charcoal pitch （CTP） smoke extract was established， and estradiol （E2） was used as a representative to study the role of estrogen in the CTP-induced mouse lung cancer model.Methods  260 5-week-old clean-grade female KM mice were randomly divided into 9 groups： CTP group （27）， CTP+ E2 group （28）， CTP+TAM group （29）， CTP+E2+TAM group （28）， E2 group （34）， TAM group （30）， E2+TAM group （29）， solvent control group （27）， blank control group （28）， each group different doses of treatment were given，and the growth， activity， diet and health of the mice were observed and recorded weekly， and the body weight was weighed. After 10 weeks of exposure， the lung tissues of each group were collected. After HE staining， the histopathological changes were observed under microscope. The number of tumors was observed and the incidence of lung cancer was calculated.Results  The incidence of lung cancer in mice with CTP+ E2+TAM group was 32.14%. The incidence of lung cancer and the number of tumors were lower than those in CTP+ E2 group， the difference was not statistically significant （P>0.05）. The incidence of lung cancer in mice in CTP group was 26.92%. The incidence of lung cancer and the number of tumors were higher than those in the solvent control group and the blank control group （P<0.05）. The CTP+ E2 group incidence of lung cancer was the highest， which was 57.14%. The incidence of lung cancer and the number of tumors were higher than those of the control group and E2 group （P<0.05）. The tumors confirmed by HE staining of tumor nodules were adenomas， and the boundaries with normal lung tissues were clear.Tumor tissue is arranged in adenoids， mainly under the nuclear membrane. Conclusion  An animal model of lung cancer induced by CTP smoke extract in female KM mice was established. E2can promote lung cancer induced by CTP smoke extract.

Key words：Coal tar pitch smoke;Estrogen;Lung cancer

癌症是当今人类面临的巨大问题之一，其中肺癌是全世界癌症死亡的首要原因[1]。煤焦沥青（coal tar pitch，CTP）可经皮肤、呼吸道、消化道等途径对人体健康造成损伤。目前流行病学与动物实验均已证实煤焦沥青具有致癌性，特别是对肺癌具有高度选择性。CTP主要成分是多环芳烃类混合物（polycyclicaormatic hydorcarbons，PAHs），长期接触者肺癌的发病率明显高于正常人群[2]。虽然CTP诱发肺癌的机制研究已有一定进展，但其确切的机制仍不清楚。流行病学调查表明，女性对吸烟引起的肺癌比男性更敏感，在吸烟量相同的情况下，女性更容易引发肺癌[3]，这可能与女性体内雌激素水平较高有关。人类癌症实验动物模型具有研究周期短、实验条件容易控制以及可以全程观察肿瘤的发生发展等优势[4]。本实验拟建立以CTP烟提取物灌胃诱发雌性KM小鼠肺癌的动物模型，并以雌二醇（17β-estradiol，E2）為代表，研究雌激素对该肺癌的影响，为进一步研究CTP烟提取物诱发肺癌的作用机制以及肺癌的防治提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物  5周龄雌性KM小鼠260只，体重18～20 g（购于山东第一医科大学实验动物中心），均为清洁级动物。课题项目将自觉接受山东第一医科大学（山东省医学科学院）实验动物伦理委员会的监督与审查，并保证符合实验动物伦理原则要求，申报审查的材料客观真实可靠。

1.2主要试剂  中温煤焦沥青烟提取物，由中国铝业股份有限公司河南分公司提供;E2购于美国Sigma公司，纯度≥98%;他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）购于购于美国Sigma公司，纯度≥98%;橄榄油购于超市，ANANIAS特级初榨橄榄油，希腊原装进口。

1.3实验方法

1.3.1动物处理与形态学观察  将260只KM小鼠按随机原则分为9组，分别为CTP组（27只）、CTP+E2组（28只）、CTP+TAM组（29只）、CTP+E2+TAM组（28只）、E2组（34只）、TAM组（30只）、E2+TAM组（29只）、溶剂对照组（27只）、空白对照组（28只）。在前期研究的基础上，CTP：3 μmol/（只·周），溶于0.1 ml橄榄油中灌胃，1次/周，持续8周。E2：1.8 μg/（只·周），溶于0.05 ml橄榄油中皮下注射，1次/周，持续8周。TAM：2 mg/（kg·d），溶于0.05 ml橄榄油中皮下注射，1次/d，持续8周。溶剂对照组通过相应途径给予等量橄榄油处理。染毒后10周宰杀小鼠，收集各组肺组织，并记录小鼠体重变化、肺癌发生率以及肿瘤数。制作各组肺组织的病理切片，HE染色后，显微镜观察组织病理变化情况。

1.3.2肿瘤数和肿瘤发病率计算  肿瘤数=每组肿瘤结节数/该组存活的小鼠总数;肿瘤发生率（%）=每组发生肿瘤的小鼠数/该组存活的小鼠总数×100%。

1.4统计学方法  采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以（x±s）表示，多组数据间比较采用方差分析，计数资料以（%）表示，采用？字2检验。α=0.05为检验水准，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1一般情况  个别小鼠在实验初期偶有躁动表现，大部分精神状态良好，饮食正常，体重有所增加，随实验进行大部分小鼠饮食量减少，除溶剂对照组和空白对照组外，体重均增长缓慢，以CTP+E2组最为明显，所有动物对实验干预良好，没有因为实验干预直接导致的死亡，其中CTP组、CTP+TAM组和E2+TAM组因生病和打斗分别死亡1只、2只和2只。

2.2小鼠的肿瘤数和肿瘤发病率  E2组肺癌的发病率与溶剂对照组和空白对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）;TAM组肺癌发病率高于对照组且低于CTP组，差异均无统计学意义（P>0.05）;CTP组肺癌发生率和肿瘤数高于溶剂对照组和空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;CTP+E2组的肺癌发病率和肿瘤数最高且高于对照组和单纯E2组，差异均有统计学意义（P<0.05）;CTP+E2+TAM组小鼠肺癌发病率和肿瘤数都低于CTP+E2组，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.3形态学与病理学诊断  病变肺表面可以看到明显的肿瘤结节，质地较坚硬，直径约1～3 mm。所有HE染色确诊的肿瘤均为腺瘤，肺组织内可见较大肿块，与正常肺组织分界清楚。肿瘤组织呈腺样排列，肿瘤间质少，瘤细胞胞体呈圆形，胞浆粉红色瘤细胞核圆形，深染，染色质呈粗颗粒状，主要位于核膜下。

3讨论

环境污染、人们生活方式的改变，引发多种严重的心血管疾病和呼吸系统疾病，尤其是恶性肿瘤的发病率呈现逐年上升趋势。研究显示[5]，许多国家和地区肺癌死亡率已居于肿瘤死亡率之首。近年来，中国农村和城市中肺癌的发病率和死亡率均有较大幅度的上升，且女性肺癌的发病率和死亡率均有所增加，一方面可能是由于女性吸烟人数不断增加，另一方面可能是由于在吸烟量相同的情况下，女性相对于男性更易引发肺癌，这可能与女性体内雌激素水平较高有关。

当前，煤炭仍是中国能源的主要来源之一，主要应用于热力学和焦炭生产。煤焦沥青是煤焦油炼焦过程中形成的废渣，约占整个炼焦过程的54%～56%，主要应用于粘合剂、防水材料、抗腐蚀材料和公路建筑材料等。煤焦沥青成分复杂，主要成分为PAHs，比如蒽、菲、芘等[6]，是危害职业人群的重要毒物[7]。煤焦沥青烟气及在空气中形成的气溶胶是人们日常生活以及职业接触的主要形式。流行病学调查已证实CTP具有致癌性，它所引起的肺癌已经归于职业肿瘤。因此，从确切的致癌物煤焦沥青出发，研究其致癌过程的发病机制尤为重要和迫切。

广义上将肺癌分为两种类型：小细胞型肺癌（SCLC），约占15%;非小细胞型肺癌（NSCLC），约占85%，非小细胞肺癌主要包括鳞癌、腺癌、大细胞癌、鳞腺癌等。有数据显示，Ⅰ期NSCLC及时进行手术切除，5年生存率高达70%～90%[8]。尽管现在肺癌诊断技术有重大进展，仍有约75%的肺癌患者在确诊时已经进入Ⅲ/Ⅳ期[9]。近年来对晚期肺癌患者的管理虽有明显进步，但其生存质量仍然很低。2014年英国国家统计局报道，Ⅳ期肺癌患者的1年生存率仅有15%～19%[10]。肺癌的治疗主要包括局部治疗和全身治疗。局部治疗以手术治疗效果最佳，但无法控制少量癌细胞转移的情况，且手术治疗容易使患者身体免疫力下降，预后较差。全身性治疗主要包括化疗、分子靶向药物治疗等。全身性治疗虽对原发灶和微转移灶均有杀伤作用，但毒性较大，仍需改进。现阶段，肺癌的临床多学科多方式合作的综合治疗模式水平虽然不断提高，但其远期疗效和预后仍未带来突破性的进展，迄今为止国内外对肺癌发病机理认识仍然尚不深入与充分，防治依然缺乏根本性有效措施。因此，亟須寻找肺癌防治新策略。

课题组前期对煤焦沥青加热收集其烟气，并对其进行GC-MS分析，PAHs占总成分的90.98%。研究显示煤焦油致癌能力要高于B（a）P[11]，说明煤焦沥青中可能含有比B（a）P致癌能力更强的物质，或者其中的各种成分在机体中相互作用使其致癌能力增强。职业性接触煤焦沥青多呈烟气或气溶胶形式，因此本研究采用煤焦沥青烟提取物作为染毒物，比较接近实际情况，有助于了解多种化学物质对机体的联合毒作用，对于探讨煤焦沥青所致肺癌的机制，对肺癌的预防及治疗均有重要意义。本研究显示，CTP组小鼠肺癌发生率和肿瘤数高于溶剂对照组和空白对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），表明CTP具有致癌性，能够引发小鼠肺癌，同时也证实本次实验成功建立了CTP灌胃诱发肺癌的动物模型。

雌激素为一种类固醇激素，以E2为代表。雌激素受体（estrogen receptor，ER）拮抗剂TAM，作为信号传导抑制剂之一，在治疗乳腺癌过程中获得显著疗效。研究已证实ER不仅存在于乳腺癌组织中，也广泛存在于肺癌组织中。雌激素信号通路不仅在生理、病理过程中具有重要的作用，在癌症发生过程中的作用也有广泛研究，尤其是在乳腺癌方面。1895年Beatson率先对3例乳腺癌应用卵巢切除降低雌激素水平使得肿瘤得到良好控制。一项西方国家研究显示[12]，85%～90%的肺癌患者存在吸烟情况，但另一项研究却显示[13]，尽管世界范围内女性肺癌患者有80%有吸烟史，台湾女性肺癌患者中吸烟者却仅有10%。两性无吸烟史的肺腺癌患者的患病率并无差别，该项研究似乎说明有无吸烟史更像是一个预后影响因素而非危险因素[14]。相对于绝经后女性，绝经前女性肺癌患者的生存率更低。伴随着当代肿瘤内分泌学与药物生产技术取得的飞速发展，其中调控雌激素状态抗癌的内分泌疗法已经成为多种恶性肿瘤治疗的重要手段。近年来学者们研究发现[15]雌激素与肺癌的发生、发展也有着密切关系，尤其雌激素的主要成分之一雌二醇及其受体在其中起着重要作用。本研究显示，E2组肺癌的发病率与溶剂对照组和空白对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），提示E2不是致癌物;TAM组肺癌发病率高于溶剂对照组和空白对照组且低于CTP组，但差异均无统计学意义（P>0.05），表明TAM也不是致癌物。但CTP+E2组的肺癌发病率和肿瘤数最高且高于溶剂对照组、空白对照组和E2组，差异有统计学意义（P<0.05），证明E2可以促进CTP所致小鼠肺癌的发生。CTP+E2+TAM组小鼠肺癌发病率和肿瘤数都低于CTP+E2组，虽然差异无统计学意义（P>0.05），但表明TAM在一定程度还是降低了雌激素对CTP所致小鼠肺癌的促进作用，验证了TAM对雌激素的拮抗作用。

综上所述，此次应用雌性KM小鼠成功建立了CTP烟提取物导致肺癌模型。模型的成功建立，为下一步有关CTP烟提取物导致肺癌及E2和TAM干预机理的研究奠定了基础，也使后续工作成为可能。

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收稿日期：2019-4-26;修回日期：2019-5-30

編辑/杨倩