李 凡，赵坤坤，刘守川

（洛阳中科基因检测诊断中心有限公司，河南 洛阳 471000）

腹泻是养猪生产中常见的疾病之一，各日龄猪均可发病，可造成哺乳仔猪大量死亡，使世界养猪业遭受了巨大的经济损失。临床上有多种原因可引起猪腹泻，如病毒病、细菌病、寄生虫病、营养性以及中毒等因素均可导致猪腹泻的发生，而猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）是临床上引起腹泻的重要病原之一[1]。猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由PEDV引起的一种急性、高度接触性肠道传染病[2]，以腹泻、呕吐和脱水为典型症状。一年四季均可发病，冬、春季节多发。不同年龄、性别和品种的猪均可感染，其中哺乳仔猪的发病率和死亡率最高，成年猪症状较轻，但可长期隐性带毒[3]。

PEDV属于冠状病毒科（Coronaviridae）、α冠状病毒属（Alphacoronavirus）成员，PEDV为有囊膜的、不分节段的、单股正链RNA病毒，基因组全长约28 kb[4]，主要包含编码结构蛋白的S、E、M和N基因，以及编码非结构蛋白的ORF3基因[5]。S基因编码的纤突糖蛋白（S蛋白），在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要生物学作用[6]。PEDV的ORF3基因位于S基因下游的第116～784个核苷酸处，编码224个氨基酸，ORF3编码的蛋白是唯一的辅助蛋白[7]。

猪流行性腹泻是影响当前养猪业的重大疾病之一，自2010年底，PED在我国大规模暴发[8-9]，一直未能得到有效控制，给我国养猪业造成了极大的经济损失[10]。而河南地区的PEDV流行情况还有待于进一步的研究。对当前养殖场中PEDV流行毒株的S基因进行测序，采用生物信息学软件将S基因序列与GenBank收录的PEDV参考毒株进行同源性比较、遗传进化分析，有助于阐明PEDV流行毒株致病机制、摸清PEDV的流行特点和变异情况，为该病的免疫防控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 病料采集

2018年河南部分地区腹泻发病猪场采集、剖检并取典型病变部位组织，送至实验室，-20℃保存、待检。

1.2 主要试剂

36T核酸提取试剂盒和64T核酸提取试剂盒均为洛阳爱森生物科技有限公司产品；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix为北京全式金生物技术有限公司产品；10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTP Mix、5 U/μL rTaq DNA 聚 合 酶 、6 ×Loading Buffer和琼脂糖均为TaRaKa公司产品；溴化乙锭为生工生物工程（上海）股份有限公司产品；1×TAE电泳缓冲液、灭菌双蒸水、青霉素、链霉素和1×PBS为实验室自配。

1.3 引物的设计和合成

根据国家标准中的引物和GenBank中发表的基因组序列设计扩增的引物，引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，具体的引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 总RNA的提取、cDNA的反转录和各基因片段的扩增

按照洛阳爱森生物科技有限公司核酸提取试剂盒的说明书操作，提取总RNA；参考EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书配制反转录体系并进行反转录。按照TaRaKa公司rTaq DNA聚合酶说明书配制PCR体系，PCR反应程序为 95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51～56 ℃ 40 s，72 ℃40～50 s，共 35个循环；72 ℃ 10 min。PCR 结束后，取6 μL扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，并用紫外凝胶成像仪拍照。

1.5 PCR产物测序

将PCR产物和相应的引物送至通用生物系统（安徽）有限公司测序。

1.6 测序结果分析

将测序结果用DNA Star软件中的Seqmen进行序列分析，并用Megalign进行同源性分析，同时用MEGA 6.0进行分析并绘制系统进化树。

2 结果与分析

2.1 腹泻相关病原的检测

对河南省内4个地区的10份病料按照采样时间进行命名（表2），并进行腹泻相关病毒的RTPCR检测（图1，A），结果表明，大部分猪场的腹泻多为混合感染，有的甚至多达3种病毒混合感染，其中PEDV的检出率最高，为80.0%，其次为PoRV，为30.8%，TGEV的检出率为7.7%。

2.2 PEDV S基因的扩增

对PEDV检测为阳性的8份病料进行S基因部分序列的扩增。电泳结果显示（图1，B），8份样品分别在532 bp处有特异性扩增条带，与预期相符。

表2 PEDV河南分离株信息及编号

图1 腹泻相关病毒和PEDV S基因PCR结果

2.3 基因序列核苷酸同源性分析

8株PEDV的S基因部分序列相互之间的核苷酸同源性为82.8%～100%（图2），它们与参考毒株序列（表3）的同源性为82.2%～100%。其中180276-3和180276-6与DR-13的同源性最高，分别为94.9%、94.7%，180278-1与AJ1102的同源性最高，为97.8%，180435-1与DR-13的同源性最高，为95.2%，181212-1与CV777和SD-M的同源性最高，均为99.2%，181737-1和181737-2与HEN-ZMD-2012和K14JB01等的同源性最高，均为100%，181753-1与DR-13的同源性最高，为94.9%。

表3 PEDV参考毒株信息

2.4 遗传进化分析

根据S基因构建的进化树分为2个基因群，第1个和第2个基因群均又分为3个基因亚群（图3）。本实验室扩增的基因序列分别属于4个基因亚群，181737-1和181737-2属于第1个基因群的第1亚群，为流行株，与HEN-ZMD-2012最相似；180278-1属于第1个基因群的第2亚群，为流行株，与HeN-2018 最 相 似 ；180276-3、180276-6、180435-1 和181753-1属于第2个基因群的第1亚群，更接近于经典株，与LZC最相似；181212-1属于第2个基因群的第3亚群，更接近于疫苗株，与CV777最相似。

图2 PEDV S基因与参考毒株的同源性分析结果

图3 PEDV S基因进化树结果

2.5 PEDV S基因突变位点分析

临床的PEDV疫苗多为CV777，将河南地区的PEDV毒株与CV777比较，发现其S基因存在不同位点的氨基酸位点的突变、插入和缺失，具体见表4。

3 讨论

PEDV是当前引起仔猪腹泻的重要病原之一，仔猪感染后主要症状为呕吐、水样腹泻、脱水并死亡。本试验对5个猪场的10份临床样品进行检测，发现PEDV检出率为80.0%，PoRV为30.8%，TGEV仅为7.7%，由此可知，PEDV和PoRV在腹泻病例中发挥重要的作用，这一结果与之前的研究结果类似[11]。多种腹泻病原的检出也表明了临床养猪生产中猪群腹泻病原的多样化和复杂化，临床上的猪腹泻疫情防控将变得更加严峻。临床检测腹泻的猪场大多已经免疫了TGEV-PEDV二联疫苗，但这些猪场均检出了PEDV，说明二联疫苗不能为现有的流行毒株提供有效的保护，所以对于PEDV流行毒株的S基因的分子流行病学监测，对预防和控制PED具有重要意义。

本试验扩增的S基因部分片段位于S1区，含有PEDV的中和抗原表位[12-13]，S基因核苷酸同源性比对发现，不同病料样品的S基因与不同的参考株的同源性有差别。对S基因进行遗传进化分析可知，S基因在地域上有差异，不同地域的样品属于不同的基因群和基因亚群，并与不同的代表毒株在一个分支。本试验将河南地区的8株PEDV的S基因和疫苗毒株CV777的S基因的氨基酸位点进行比对发现：所有毒株均有不同程度的氨基酸位点的突变，从表4中可知，181212-1有5个突变，与CV777最相似，181753-1有 9个突变，180276-3、180276-6和180435-1均有10个突变，181737-1和181737-2均有32个突变，均有2个缺失和3个插入，180278-1有34个突变，有2个缺失和3个插入。这些氨基酸位点的突变可能会影响S抗原位点产生中和抗体的能力，从而改变流行毒株的抗原性。这对做好PEDV的防控、选择合适的PEDV疫苗株提供了理论参考。

表4 S基因推导氨基酸突变与CV777比对分析结果