魏 其，董 斌，屈勇刚，谷思颖，吴圆圆，于会举

（石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000）

2015年，美国堪萨斯州立大学兽医学诊断实验室Palinski等[1]从患有皮炎肾病综合征与繁殖障碍的猪中，通过宏基因组测序及遗传进化分析检出了一种新型猪圆环病毒（Porcine circovirus），将其命名为猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）[2]。

PCV3呈二十面体结构，无囊膜，基因组为单股的DNA，它的全长为2 000 bp。包括3个主要开放阅读框（ORF）[3]，其中 ORF1 编码复制酶蛋白 rep，由297个氨基酸组成；ORF2编码由214个氨基酸组成衣壳蛋白Cap，两者复制方向相反；目前关于ORF3的研究仍不健全，在Rep和Cap基因间隔区5'端存在茎-环结构[3-4]，Cap蛋白是PCV重要的构成蛋白，可引发机体产生特异性免疫应答。

PCV3作为一个新发现的病毒，流行的范围较广。2016年以来前后有美国、中国、韩国、巴西、波兰等国报道发现此病毒。截至目前，我国已有28个省市猪场存在PCV3感染。北疆地区PCV3的感染及其流行程度、危害程度目前尚不清楚，急需开展相应工作。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 试验于2019年4—8月在石河子大学进行。样品取自北疆某具有代表性的规模化养猪场，并采取 0~6、7~13、14~20、21~27、28~39、40~59、60日龄猪以及母猪血样各5份，共40份血液样品，于-80℃温度下保存。

1.1.2 主要试剂及试验仪器 试验主要试剂：pEASY-T1 Simpie Cloning Kit、2K DNA Marker、2×EasyTap PCR SuperMix（购自全式金生物技术有限公司），TIANGENG Genomic DNA Kit（购自天根生化科技有限公司），FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit（购自南京诺唯赞生物科技有限公司），氯化钠，酵母粉，胰蛋白胨，琼脂粉，氨苄青霉素，50%甘油。

试验所需仪器：净化工作台、HH-s3数显恒温水浴锅、高速台式离心机、梯度PCR仪、电子天平、冰箱、微波炉、制冰机、高压蒸汽灭菌锅、核酸电泳仪、凝胶成像系统。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取 按照TIANGENG Genomic DNA Kit提取试剂盒说明书提取DNA。

1.2.2 巢式PCR扩增 按照参考文献[4]合成PCV3分离株的部分衣壳基因序列PCV-F1R1和PCV3F2R2，引物由北京华大基因科技有限公司合成，引物序列如表1。利用巢式PCR方法进行基因检测，PCR 的反应体系：Mix 15 μL，ddH2O 11 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模板1 μL。扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃终延伸10 min。

表1 PCV3引物序列

1.2.3 扩增产物回收纯化 取PCR产物7 μL，利用凝胶电泳试验，通过凝胶成像仪观察电泳结果。

PCR产物与目的条带大小一致为阳性条带，并将相应大小条带的胶切下，使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit进行凝胶回收纯化。

1.2.4 DNA连接转化 连接至pEASY-T1载体上，转入感受态细胞Transl-T1，通过Amp/LB抗性进行筛选。

1.2.5 菌液PCR验证 在含有氨苄青霉素的LB平板上培养8~10 h，在平板上不同区域挑取10个单个菌落，将其分别接种于1 mL的含有氨苄青霉素的LB液体培养基的离心管中，并做好标记，置于37℃、180 r/min的震荡培养箱中培养6 h，使用pEASY-T1 Simple Cloning Kit进行菌液的PCR验证。阳性克隆菌落经PCR进一步鉴定后，保存于50%的灭菌甘油中。1.2.6 序列测定与分析 将验证后的阳性克隆送北京华大基因生物技术公司测序，将测序结果运用MEGA 6.06软件进行比对和分析。

2 结果

2.1 巢式PCR检测结果

PCR检测得到的目的片段扩增的片段大小约为329 bp。在检测的40份样品中，有20份样品PCR检测阳性，平均阳性率为50%（20/40）。在该猪场0~6日龄猪阳性率达60%（3/5）；7~13日龄猪阳性率达80%（4/5）；14~20日龄猪阳性率达 80%（4/5）；21~27日龄猪阳性率达40%（2/5）；28~39日龄猪阳性率达 40%（2/5）；40~59日龄猪阳性率达 20%（1/5）；60日龄猪阳性率达20%（1/5）；母猪阳性率达60%（3/5）。阳性样品呈明亮条带，如图1。

图1 PCV3基因片段的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 菌液PCR鉴定结果

菌液PCR结果与目的基因大小一致（329 bp），如图2。

2.3 PCV3序列的测定与分析

经测序后大小与目的大小一致，将其中2株PCV3基因序列，运用MEGA 6.06软件与国内外13株PCV3参考序列进行遗传进化情况分析，建立的遗传进化树如图3。结果表明本试验所获得的2株基因序列与中国河北株MH101645.1 PCV3CHHBHD2017、中国湖南株MG745690.1PCV3-CN-Hunan-1、中国江西株KY354057.1PCV3-CN-Jiangxi-28-2016、韩国株 KY 996345.1 PCV3KU-1609、墨西哥株 MH192340.1 PCV3 MEXGTO012017、中国新疆株MH216037.1 PCV3-CN-Xinjiang-3-2017、中国江苏株MF769806.1 PCV3-CN-Jiangsu-170266-25、中国天津株MH579786.1 PCV3-CH-Tianjin-2-2017在同一分支，属于3a亚群。

图3 PCV3核苷酸序列的遗传进化树

运用MEGA 6.06软件将本试验所获得的2株PCV3基因序列与国内外的13株PCV3参考序列进行了同源性比较，结果发现本试验所获得的2株PCV3毒株之间的相似性很高，达99.40%。与国外参考毒株相比，同源性为97.90%~99.70%，具体见图4。

图4 北疆地区猪场与国内外PCV3基因序列同源性分析

3 讨论与分析

2015年首次报道PCV3的发现后，许多国家均陆续检测到PCV3的DNA，在中国已有28个省市的商业养猪场中发现PCV3[5-11]。在断奶仔猪、保育猪和母猪中都检测到了PCV3，这些结果证明了在猪生长的不同时期都有可能感染该病毒，这种感染动态与PCV2形成对比，后者主要感染5~12周龄的猪，而在哺乳期则很少感染猪[11-12]。这可以通过以下事实来解释：初乳中的抗体对哺乳仔猪具有保护作用，然后在哺乳期和断奶期抗体随之下降。一旦母体产生的抗体减弱，就会发生活跃的血清转化，而后容易被感染[12-14]，这种血清变化通常发生在9~15周龄之间，抗体至少可能持续至28周龄[13-16]。但是目前完全缺乏关于PCV3的母猪感染、母体免疫力以及免疫力如何保护的信息。众所周知，PCV3可以在初乳中被发现[17-19]，这代表着有垂直传播（母猪播种）的可能性并强调早期感染的潜在重要性。同样，本试验中在0日龄的仔猪体内检测到阳性率为60.0%（3/5），母猪阳性率为60.0%（3/5），这可能是存在母体本身已感染PCV3，通过胎盘直接传播，引起仔猪一出生就带有该病毒。7~13日龄猪、14~20日龄猪PCV3阳性率为80.0%，21~27日龄、28~39日龄为40.0%，40~60日龄为20%，日龄越大阳性率越低，初步可以推测日龄大的猪经过免疫力的提高对该病毒抵抗力越好，感染该病毒的概率越低，本试验结果与上述研究结果一致，但是目前该研究还较少，还需进一步深入研究证实。

遗传进化分析表明，本试验得到的2株序列与中国河北株MH101645.1 PCV3CHHBHD2017、中国湖南株MG745690.1 PCV3-CN-Hunan-1、中国江西株KY354057.1PCV3-CN-Jiangxi-28-2016、韩国株KY996345.1PCV3KU-1609、墨西哥株MH192340.1 PCV3MEXGTO012017、中国新疆株 MH216037.1 PCV3-CN-Xinjiang-3-2017、中国江苏株MF769806.1 PCV3-CN-Jiangsu-170266-25、中国天津株MH579786.1 PCV3-CH-Tianjin-2-2017在同一分支，同属3a亚群。结果发现PCV3毒株之间相似性很高。

目前关于PCV3的了解很少，并已被确定为与猪病相关的病原体。然而，新疆地区PCV3的流行状况和遗传特征尚不清楚。本试验在新疆地区检测出该病毒，我们推测PCV3是一种可以根据上述结果垂直传播的潜在病原体。以上结果对于更好地了解中国的PCV3至关重要，但是需要进一步研究以分离PCV3，探索其生物学和致病性特征。