李水仙 夏从龙 陈丽元

摘 要 目的：对藏药“蒂达”的3种基源植物紫红獐牙菜、青叶胆和椭圆叶花锚进行亲缘关系研究。方法：利用简单重复序列区间（ISSR）分子标记技术对紫红獐牙菜9个样品（样品ZT-1～ZT-5采自大理苍山感通寺，样品ZC-1～ZC-4采自大理宾川县）、青叶胆2个样品（QYD-1～QYD-2）和椭圆叶花锚2个样品（HM-1～HM-2）进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。采用青叶胆的DNA基因组为模板DNA进行引物筛选，对筛选得到的8条引物进行PCR反应；对PCR扩增产物进行人工读带，建立原始数据矩阵，并计算多态性条带比率；同时，采用NTSYS 2.1软件计算遗传相似系数，并选择UPGMA法绘制聚类图。结果：通过8条ISSR引物共反应获得113条清晰可辨的PCR扩增产物条带，多态性位点百分率为100%。紫红獐牙菜、青叶胆和椭圆叶花锚3个品种共13个样品的遗传相似系数在0.301～0.500之间；紫红獐牙菜9个样品的种内遗传相似系数在0.752～0.929之间。聚类分析结果显示，当距离线为0.410时，可将13个样本分为3个类群，即青叶胆、椭圆叶花锚、紫红獐牙菜；当距离线为0.780时，可将紫红獐牙菜的9个样品分為2个亚类，一个亚类只有苍山感通寺采集的样品ZT-1，另一个亚类含有其余8个样品。结论：利用ISSR分子标记技术能从分子水平对紫红獐牙菜、青叶胆和椭圆叶花锚进行鉴别。紫红獐牙菜与青叶胆、椭圆叶花锚存在一定的亲缘关系，但亲缘关系相对较远、遗传差异较大；大理地区两个不同地点产紫红獐牙菜的遗传差异较小、亲缘关系较近，但表现出丰富的遗传多样性。

关键词 ISSR分子标记技术；紫红獐牙菜；青叶胆；椭圆叶花锚；鉴定；亲缘关系；遗传多样性

Analysis of the Phylogenetic Relationships of 3 Basic Plants of Tibetan Medicine “Dida” Based on ISSR Technology

LI Shuixian1，XIA Conglong1，CHEN Liyuan2（1. Pathology Teaching and Research Section， College of Basic Medicine， Dali University， Yunnan Dali 671000， China； 2. Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650032， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the phylogenetic relationships of 3 basic plants of Tibetan medicine “Dida”， such as Swertia puricea， Wertia mileensis， Halenia elliptica. METHODS： ISSR technology was used for PCR amplification of 9 samples of S. puricea （ZT-1 to ZT-5 from Gantongsi in Dali Cangshan， ZC-1 to ZC-4 from Binchuan county of Dali）， 2 samples of W. mileensis （QYD-1 to QYD-2） and 2 samples of H. elliptica （HM-1 to HM-2）. Using DNA genome of S. puricea as template， 8 primers were screened and used for PCR reaction. The PCR amplification products were read by hand， the original data matrix was established， and the polymorphic band ratio was calculated. At the same time， genetic similarity coefficient was calculated by using NTSYS 2.1 software， and UPGMA method was used to draw cluster diagram. RESULTS： A total of 113 clear and identifiable amplification product bands were obtained by 8 ISSR primers. The rate of polymorphic site was 100%. The genetic similarity coefficients for totally 13 samples of S. puricea， W. mileensis and H. elliptica ranged 0.301-0.500. Intraspecific genetic similarity coefficients for 9 samples of S. puricea ranged from 0.752 to 0.929. The cluster analysis showed， when the range line was 0.410， 13 samples could be divided into three groups， i.e. S. puricea， W. mileensis， H. elliptica； when the range line was 0.780， 9 samples of S. purpurea could be divided into 2 subgroups， one of which was only sample ZT-1 collected from Gantongsi in Cangshan， and the other contained the remaining 8 samples. CONCLUSIONS： ISSR technology can be used to identify S. punicea， S. glabra and H. elliptica at the molecular level. S. punicea has some genetic relationship with S. glabra and H. elliptica， but the genetic relationship is relatively distant and the genetic difference is large. S. punicea from two different locations in Dali area has little genetic difference and close relationship， but it shows abundant genetic diversity.

KEYWORDS ISSR； Swertia puricea； Swertia mileensis； Halenia elliptica； Identification； Phylogenetic relationship； Genetic diversity

简单重复序列区间（Inter-simple sequence repeat，ISSR）是由加拿大蒙特利尔大学Zietkeiwitcz E等[1]在聚合酶链式反应（PCR）基础上提出的分子标记技术，其基本原理是以锚定的微卫星DNA为引物，在简单重复序列（SSR）的3′端或5′端加上1～4个随机核苷酸，锚定引物可在PCR反应中引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。ISSR分析具有操作方便、精确、快速、高效且DNA用量少等优点[2]，目前已广泛应用于植物品种鉴定、基因定位、遗传多样性分析等研究中[3-5]。

“蒂達”是藏药中治疗肝胆疾病最具有代表性的常用药物之一，具有悠久的用药历史，它是指“味苦，能治疗肝胆疾病”的一类功效相近的药物的总称[6-7]。《晶珠本草》中有记载：“蒂达可清热，治胆病、血病，有清肝利胆、退诸热的作用”[8]。藏药“蒂达”品种繁多、基源复杂，涉及到龙胆科獐牙菜属、花锚属、扁蕾属、肋柱花属、喉毛花属及虎耳草科虎耳草属、唇形科等多种植物[6，9-10]。龙胆科植物为“蒂达”常用药用植物之一，其中龙胆科植物青叶胆（Swertia mileensis T. N. Ho. et L. Shih）、椭圆叶花锚（Halenia elliptica D. Don）为其主要药用基源植物，但由于资源需求量较大、过度开采，目前已濒临灭绝[11-13]。藏医常用同科植物紫红獐牙菜（Swertia puricea Hemsl）进行替代使用。目前对青叶胆、椭圆叶花锚和紫红獐牙菜的成分及药理作用研究较多[14-18]，而从分子水平对三者进行亲缘性分析的研究尚未见报道。因此，本课题组利用ISSR分子标记技术对藏药“蒂达”3种基源植物（青叶胆、椭圆叶花锚、紫红獐牙菜）的亲缘关系进行评价并进行遗传学多样性分析，为紫红獐牙菜作为“蒂达”基源的替代使用提供可靠依据，也为青叶胆及其近缘种药用植物的遗传改良、选种育种、亲本选配、种质保护和核心种质构建等提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

Applied Biosystem 2720型PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；GBOX HR型化学发光凝胶成像系统（英国Syngene公司）；DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；UV-1102型紫外分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）。

1.2 试剂

溴代十六烷基三甲胺（CTAB，美国Amresco公司，批号：0833）；2×Taq PCR Master Mix试剂[包含0.1 U Taq DNA聚合酶、0.5 mmol/L d NTP、20 mmol/L Tris- HCl（pH 8.3）、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2]、TE洗脱缓冲液（北京天根生化科技有限公司，批号分别为KT201、RK121-03）；DNA Marker、琼脂糖[生工生物工程（上海）股份有限公司，批号分别为B500347、A610013]；其余试剂均为国产分析纯，水为双蒸水（dd H2O）。

1.3 药材

所有药材样本均采自云南省不同地区（药材样品来源见表1）。所采植物由大理学院药学与化学学院夏从龙教授鉴定分别为龙胆科獐牙菜属紫红獐牙菜（S. puricea Hemsl）、龙胆科獐牙菜属青叶胆（S. mileensis T. N. Ho. et L. Shih）、龙胆科花锚属椭圆叶花锚（H. elliptica D.Don）的原植物。各植物取新鲜叶片，用变色硅胶迅速干燥，于4 ℃冰箱保存。

1.4 引物

ISSR引物根据不列颠哥伦比亚大学（University of British Columbia）公布的序列设计[19]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 方法

2.1 样品DNA的提取

采用改良的CTAB法[20]提取3种植物样品中的全基因组DNA；采用琼脂糖凝胶电泳法结合紫外分光光度法检测DNA的质量浓度后，用TE洗脱缓冲液稀释至50 ng/μL，备用。

2.2 引物筛选

根据预实验结果，采用青叶胆药材的DNA基因组为模板DNA进行引物的筛选，从生工生物工程（上海）股份有限公司合成的100条引物中筛选出8条能扩增出多态性条带、背景清晰、反应稳定的引物，用于后续的样本ISSR分析。8条引物序列详见表2。

2.3 PCR反应

采用PCR仪进行ISSR-PCR扩增。体系组成（总体积为25 μL）：2×Taq Master Mix 12.5 μL，引物1 μL，DNA模板3 μL，加dd H2O至25 μL。扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，约52～56 ℃（不同引物按照表2中退火温度进行微调）退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物以DNA Marker为内参，经1.5%琼脂糖凝胶电泳1.5 h，采用凝胶成像系统照相并记录结果。

2.4 数据处理

根据迁移率对8条引物反应所得PCR扩增产物的凝胶电泳图进行人工读带，选取稳定清晰的条带进行统计分析。每个条带（即DNA片段）均记为1个分子标记，代表1个引物的结合位点。根据分子标记的有无（“有”赋值为1，包括强带和重复性好的弱带；“无”赋值为0）统计所有的二元数据，从而得到原始数据矩阵，并计算多态性条带比率。采用NTSYS 2.1软件计算遗传相似系数，并选择UPGMA法绘制聚类图。

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（收稿日期：2018-10-17 修回日期：2019-04-26）

（编辑：段思怡）