陈玉秀 - 彭必武 - 李雨嫣 -

(湖南食品药品职业学院，湖南 长沙 410208)

川贝母是清咽润喉类保健食品中常见的原料，为药用植物川贝母的干燥鳞茎[1]。由于川贝母价格贵，市场零售价在4.8～6.8元/g，粉碎后易与其他同源植物，特别是浙贝母混淆。因此在《中国药典》中，采用了分子生物学鉴定方法对川贝母进行鉴别，即通过聚合酶链式—限制性内切酶多态性分析(PCR-RFLP)技术，将川贝母正品特异性的DNA条带与伪品进行区别。该方法具有特异性强、微量、准确等特点[2]，但该方法步骤复杂，操作费时。

碱裂解法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性及复性的差异进行分离，利用高pH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白质，再将pH值调至中性，由于质粒DNA较小，容易复性成双链，而染色体DNA较大，缠结成网状不溶物质，从而通过离心除去。这种方法具有操作简单、提取速度快、价格低廉、通量大等优点[3]，现已广泛用于小麦、玉米、花生、水稻[4]、番茄[5]、甜菜[6-7]等经济作物，在分子辅助育种、转基因植物鉴定、SSR鉴定等方面起到重要作用，也可用于中药材鉴定[8]，在鉴定过程中，提取高质量、高纯度的基因组DNA是开展该方面研究工作的前提和关键过程[9]。但不同的生物样本，碱裂解液不同。

试验拟通过对川贝母DNA提取所用碱裂解液进行筛选，旨在获得一种快速鉴别川贝母的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

贝母：从产地、药材市场及药店购买25个样品(见表1)，所有样品经湖南中医药大学周日宝教授鉴定，其中1号样品为正品川贝母，所有样品依次用75%乙醇、灭菌超纯水清洗，吸干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉；

2-吗啉乙磺酸(MES)、聚乙二醇4000(PEG4000)、曲拉通100(Triton X-100)：北京索来宝科技有限公司；

Low ladder(标准DNA分子)：广州东盛生物科技有限公司；

交联聚乙烯吡咯烷酮(PVP)：生工生物工程(上海)股份有限公司；

表1 贝母样品†

†※为对照样本。

rTaq酶(250 U)、SmaI酶(100 U)、10x聚合酶链式反应(PCR)缓冲液：日本TakaRa公司；

核糖核酸酶(RNaseA)：100 U，天根生物科技(北京)有限公司；

脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)：江苏康为世纪生物科技有限公司；

引物5′CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3′和5′GCTACGTTCTTCATCGAT3′：湖南艾佳生物科技股份有限公司；

乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、氯化铜等：分析纯，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

核酸定量仪：NanoDrop Lite型，美国Thermo公司；

超低温冰箱：Forma702型，美国Thermo公司；

低温台式离心机：16K-R型，长沙鑫奥仪器仪表有限公司；

医用净化工作台：SE-CJ-2D型，苏州净化设备有限公司；

荧光定量PCR仪：7300型，美国ABI 公司；

PCR仪：THERM-1000型，美国Axygen公司；

电泳仪：DYY-6C型，北京六一仪器厂；

凝胶成像系统：5000 Plus型，北京赛智创业科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 碱裂解法的筛选 碱裂解液的配置参照表2。取1号川贝母样品10份各30 mg于1.5 mL离心管中，分别加入PA1～PA10提取缓冲液400 μL及RNaseA 0.5 μL，用漩涡振荡器振荡10～15 s，混匀，65 ℃水浴加热5 min，取出。在PA1～PA5缓冲液管中分别加入0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 130 μL，在PA6～PA10缓冲液管中分别加入0.3 mol/L NaAc(pH 5.0)130 μL。分别经漩涡混匀，冰浴冷却3 min，14 000 r/min离心3 min；吸取上清液转移至另一离心管中，加入等体积(含6.0 mol/L氯化铜溶液，pH 5.5)25 mmol/L MES液，5 mmol/L MgCl2液及0.05% Triton X-100混合溶液，混匀，加到吸附柱上，10 000 r/min 离心1 min，弃过滤液，加入5 mol/L盐酸胍、25 mmol/L MES、2 mmol/L氯化镁溶液及0.05% Triton X-100混合溶液500 μL，10 000 r/min离心1 min，弃过滤液；再加入Tris-Base缓冲液500 μL，10 000 r/min离心1 min，弃过滤液；取出吸附柱，放入另一离心管中，加入50 μL洗脱缓冲液，室温放置3 min，10 000 r/min离心1 min，将洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2 min，10 000 r/min 离心1 min，取洗脱液，在核酸定量仪上测定浓度与纯度。

表2 碱裂解液配方†

† N：0.5 mol/L氢氧化钠；PVPP：1%聚乙烯聚吡咯烷酮40；NaCl：200 mmol/L氯化钠液；MgCl2：5 mmol/L氯化镁液；EDTA：2 mmol/L乙二胺四乙酸液；SDS：1%十二烷基硫酸钠；PEG：40%聚乙烯二醇4000；Tr：1%曲拉通100；PVP：1%聚乙烯吡咯烷酮；Ac：醋酸钠液；Tris：10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸液。

1.3.2 PCR-RFLP反应及电泳检测

(1) 鉴别引物：5′CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3′和5′GCTACGTTCTTCATCGAT3′。

(2) PCR反应体系：200 μL离心管中进行，反应体系总体积30 μL，包括10×PCR缓冲液3 μL，二氯化镁(25 mmol/L) 2.4 L， dNTP(10 mmol/L) 0.6 μL，上游引物(30 μmol/L) 0.5 μL，下游引物(30 μmol/L) 0.5 μL，高保真Taq DAN聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，模板1 μL，无菌超纯水21.8 μL。

(3) PCR反应参数：95 ℃预变性4 min，循环反应30次(95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min。取PCR反应液，置500 μL离心管中，进行酶切反应，反应体系总体积20 μL，包括10×酶切缓冲液2 μL，PCR反应液6 μL，Sma I(10 U/μL)0.5 μL，无菌超纯水11.5 μL，酶切反应在30 ℃水浴2 h。另取无菌超纯水，同上述PCR-RFLP反应操作，进行空白对照。

(4) 电泳检测：参照琼脂糖凝胶电泳法(中国药典四部通则0541)，胶浓度1.5%，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed；供试品与对照药材酶切反应溶液的上样量分别为8 μL，DNA分子量标记上样量1 μL(0.5 μg/μL)。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。

1.4 数据处理

采用SPSS 17.0软件对OD260 nm/OD280 nm的数据进行单因素方差分析。

2 结果与讨论

2.1 碱裂解液的确定

由图1可知，通过10种不同的碱裂解液所提DNA经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，都能扩增出条带，以PA5扩增出的条带最成功、最清晰。10种碱裂解液中分别用到了SDS、PVP、PVPP、PEG、曲拉通100、EDTA、NaCl、Tris-HCl等试剂，在DNA提取中具有不同的作用。PA5裂解液中用到了PVP、EDTA、曲拉通100等，并用Tris-HCl为中和剂，PCR扩增后电泳图结果较好，DNA浓度稍低，但OD值为1.84，接近纯品DNA(如表3所示)。这可能与裂解液中PVP等有关，有文献[10]报道PEG、PVP可降低DNA浓度。但整体而言，以Tris-HCl为中和剂的裂解液比以醋酸钠为中和剂的裂解液所得DNA浓度及纯度好。因此选择PA5碱裂解液作为川贝母DNA提取液，并对1号样品进行PCR-RFLP反应和电泳检测，结果见图2。

1. Marker 2～11. 对应表2中的PA1～PA10裂解液

Figure 1 DNA electrophoresis maps of fritillaria cirrhosae bulbus extracted from 10 kinds of alkali lysis solutions

M. Marker 1. 对照样

图2显示对照样在100～250 bp有两条清晰的DNA条带，可见利用PA5碱裂解液进行川贝母DNA提取并进行PCR-RFLP反应和电泳检测，同样可以满足《中国药典》利用分子生物学鉴别法对川贝母进行质量检测鉴别的目的。

2.2 新方法验证

由表4可知，同一样品，用药典法和试验方法在提取时间和成本上均有所不同。试验方法比药典法的提取时间要节省15～20 min，且单个样品的检验成本显著降低。

2.3 试验方法对不同川贝母样品的检测

利用试验方法对25个流通市场上所销售的贝母进行DNA提取，PCR后进行酶切前的电泳检测，对有电泳条带的样品进行RFLP检测，结果如图3～5。

由图3～5可知，1号作为对照样在100～250 bp处有2条清晰条带，且条带均匀清晰，2、3、4、12、13、15、21、22、24号样品与1号样品一致，可鉴定为正品，而其他样品与1号样品不一致，且结合外观性状，可判定为川贝母伪品。

表3 PA1～PA10碱裂解液提取DNA浓度与纯度及电泳结果

表4 两种方法对比

M. Marker 1～6. 对应表1中相同序号的贝母样品

M. Marker 1、7～11. 对应表1中相同序号的贝母样品CK. 空白

M. Marker 1、12～24. 对应表1中相同序号的贝母样品

3 结论

试验研究了采用碱裂解法提取川贝母DNA的裂解液配比比例及方法，筛选获得了200 mmol/L NaCl液，5 mmol/L MgCl2液，1% Triton X-100，1% PVP，2 mmol/L EDTA，1% SDS，0.1 mol/L Tris-HCl的裂解液可用于川贝母的DNA提取，此法不仅提取成本较《中国药典》方法中规定的商品试剂盒费用显著低，而且操作简便、快捷，符合相关保健食品企业对川贝母快速鉴定的需求。由于贝母有多种入药形式(完整药材、破碎饮片、粉末)，后续应针对基因组提取的正确取样方法进行研究，尤其是川贝母正品中掺混有少量伪品时。