于小番 - 张 琛 许慧卿 - 丁香丽 - 袁亚明AN -

(扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225000)

呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，是一种真菌毒素，主要由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)产生。DON具有多种毒性作用，包括急性毒性、慢性毒性、细胞毒性、免疫毒性等，欧盟将其定为三级致癌物[1]。由于中国的膳食结构偏向于谷物，所以呕吐毒素的危害就显得更为突出。

现有粮食中DON清除方法主要有物理脱毒法、化学脱毒法、生物脱毒法，但物理、化学脱毒方法均有不可避免的缺陷，如造成营养品质和适口性降低[2]。因此，生物脱毒法已逐渐成为研究清除粮食中DON毒素污染的重要方向，如Binder等[3]从牛瘤胃中得到一株可将DON毒素转化的细菌，He等[4]从鸡肠道中分离出对DON毒素转化率高达98%的芽孢杆菌。目前生物脱毒的研究仅集中于整菌株探索对霉菌毒素的降解作用，但究竟菌株是通过哪个部分、何种机制来达到清除DON的作用尚未见报道。

米根霉(Rhizopusoryzae)是中国传统发酵食品的重要发酵菌种之一[5]，是美国FDA认证的安全菌株[6]。米根霉在生长过程中产酶种类丰富、活力高，能产生多种有机酸[7]。已有研究[8]证实根霉菌具有一定的霉菌毒素脱毒作用。试验拟以粮食发酵中常用的米根霉菌株Rho18作为研究对象，探讨其菌悬液、发酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液、细胞壁悬液对DON毒素的清除效果，以期为研究利用微生物清除粮食中DON毒素的实践应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

米根霉菌Rho18：从传统酒曲中选育，扬州大学食品科学与工程学院营养与食品卫生实验室保存。

1.2 试验材料与仪器

呕吐毒素(DON)：美国Sigma公司；

氯化钠、甲醇：分析纯，国药化学试剂有限公司；

DON ELISA检测试剂盒：上海羽朵生物科技有限公司；

PDA培养基：青岛高科园海博生物技术有限公司；

电子天平：GL124-1SCN型，德国Sartorius公司；

超净工作台：SW-CJ-1F型，苏州净化有限公司；

台式冷冻离心机：X-22R型，德国Allegra公司；

超声破细胞破碎仪：JY920- IID型，新芝生物科技股份有限公司；

酶标分析仪：ZM-560型，中德伯尔生物技术有限公司；

液相色谱—质谱联用仪：Agilent 1200-6460 QQQ型，美国Agilent公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌悬液及发酵上清液的制备 收集稳定期(20～32 h)的Rho18发酵液，调节浓度至1012CFU/mL，随后以100倍稀释，获得高、低2个浓度(1×1012，1×1010CFU/mL)的菌液。将各浓度发酵液于4 ℃以8 000 r/min 离心10 min，收集上清液和菌体。各浓度上清液分别用0.22 μm滤膜过滤后收集，滤液即为高、低2个浓度的Rho18发酵上清液。菌体用无菌生理盐水洗涤3次后，用生理盐水重悬至原浓度，分别记为高、低2种浓度Rho18菌悬液，均于4 ℃保存备用。

1.3.2 全菌裂解液及细胞壁悬浮液的制备 取1.3.1中高、低浓度Rho18菌悬液，用超声波细胞破碎仪(输出功率700 W，间隔时间5 s，每次裂解时间5 s，裂解总时间25 min，保护温度0 ℃)对菌悬液进行裂解(至镜检无完整细胞)。过滤，收集滤液，于4 ℃以12 000 r/min离心15 min，取各浓度上清液，即为高、低浓度的Rho18全菌裂解液。对各组沉淀用生理盐水洗涤3次并重悬至原溶液体积，即为高、低浓度的Rho18细胞壁悬浮液，均于4 ℃保存备用。

1.3.3 粗提酶液的制备 取1.3.1中Rho18高、低浓度发酵上清液，于4 ℃以10 000 r/min离心20 min，上清液用0.45 μm的微孔滤膜过滤[9]收集各组滤液，即为高、低浓度的Rho18粗提酶液，均于4 ℃保存备用。

1.3.4 小麦粉样品制备 取市售小麦粉，灭菌，测定DON含量，适量添加标品DON，调节DON含量大于特征值[(2 366±187) μg/kg[10]]，40 ℃干燥至恒重。

1.3.5 菌体成分对小麦粉中DON的清除试验 分别取Rho18各浓度菌悬液、发酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液、细胞壁悬浮液，加入含有一定量DON的面粉样品中，按1∶5 (g/mL)添加；以添加PBS作空白对照，于37 ℃，140 r/min的条件下孵育培养，分别在孵育5 h和10 h时取样。

1.3.6 DON清除率的测定 样品中DON的含量采用GB 5009.111—2016中酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定，每组设置3个平行，取平均值按式(1)计算清除率。

(1)

式中：

CR——DON清除率，%；

a0——空白样中DON含量，μg/10 g；

a1——处理样中DON残留量，μg/10 g。

1.3.7 DON降解产物的定性分析 对孵育10 h后高浓度处理组的DON降解产物，参照吴娱等[11]的方法，用高效液相色谱—质谱联用仪(HPLC-MS)进行定性分析，其中模式为SEI，探头温度为250 ℃。

2 结果与分析

2.1 不同浓度Rho18菌悬液对DON的清除效果

不同浓度的Rho18菌悬液对小麦粉样品中DON的清除效果如表1所示。

表1 米根霉菌Rho18菌悬液对DON的清除率†

† 小写字母不同表示同列间的差异显著(P<0.05)；大写字母不同表示同行间的差异显著(P<0.05)；“-”表示DON清除率为0%。

由表1可知，低浓度Rho18菌悬液经5 h孵育处理组对DON的清除率最低(1.28%)；高浓度菌悬液经10 h孵育后对DON清除率为最高(37.13%)。孵育5，10 h时，高、低浓度Rho18菌悬液对DON的清除率存在显著差异(P<0.05)；低浓度菌悬液组随处理时间的延长，尽管清除率有所提高，但无显著差异。有研究[12]证实，米根霉、匍枝根霉等根霉属微生物可以降解由镰刀菌属产生的毒素。试验表明米根霉Rho18菌株对小麦粉中的DON毒素有一定的清除作用，且清除作用在10 h内与菌液的浓度、处理时间有明显的正相关性，但具体的清除机制有待进一步研究。

2.2 不同浓度Rho18发酵上清液对DON的清除效果

不同浓度的Rho18发酵上清液对小麦粉样品中DON的清除效果如表2所示。

由表2可知，小麦粉样品与高、低浓度的米根霉菌Rho18发酵上清液孵育5 h后，高浓度组DON清除率为19.44%；经过10 h孵育，高浓度组对DON的清除率(39.45%)显著升高(P<0.05)。结果表明，Rho18发酵上清液对小麦粉样品中的DON有清除作用，高浓度组延长孵育时间可以显著提高DON清除率。试验发现，孵育5，10 h后，低浓度处理组对DON的清除率显著低于高浓度组，且低浓度组孵育5 h与10 h组间无显著差异，可能与有效物质浓度过低有关。米根霉菌发酵上清液中主要为菌株代谢产物，含有多糖、有机酸及小分子蛋白质等多种有机物。其中部分有机酸具有还原型，可与DON毒素发生氧化还原反应。Marleen等[13]研究表明还原剂可改变单端孢酶烯族毒素的分子结构和生物活性。耿海荣等[14]筛选出的一株耐酸耐高温的枯草芽孢杆菌，并证实其发酵上清液中含有可清除镰刀菌产生的ZEN毒素，与试验结果相似。

表2 米根霉菌Rho18发酵上清液对DON的清除率†

† 小写字母不同表示同列间的差异显著(P<0.05)；大写字母不同表示同行间的差异显著(P<0.05)；“-”表示DON清除率为0%。

2.3 不同浓度Rho18全菌裂解液对DON的清除效果

不同浓度的Rho18裂解液对小麦粉样品中DON的清除效果如表3所示。

表3 米根霉菌Rho18全菌裂解液对DON的清除率†

† 小写字母不同表示同列间的差异显著(P<0.05)；大写字母不同表示同行间的差异显著(P<0.05)；“-”表示DON清除率为0%。

由表3可知，小麦粉样品与不同浓度的Rho18全菌裂解液经过5 h孵育后，高浓度组DON的清除率(3.44%)显著高于低浓度组(P<0.05)；经过10 h孵育，高浓度组DON清除率显著提高(P<0.05)，DON清除率呈现出随浓度升高、孵育时间增长而上升的趋势。以上结果表明，Rho18细胞内可能含有可清除DON的物质，这种物质对DON的清除作用与作用时间、全菌裂解液浓度有关。全菌裂解液中主要包括细胞器、胞内酶和一些小分子物质。推测微生物清除DON毒素的途径：① 自身代谢酶作用[15]；② 多膜结构的细胞器对DON毒素存在吸附作用[16]。孵育10 h的效果显著高于5 h，可能与酶的作用时间有关。具体何种酶具有良好的清除作用还需进一步探究。

2.4 不同浓度Rho18粗提酶液对DON的清除效果

不同浓度的Rho18粗提酶液对小麦粉样品中DON的清除效果如表4所示。

表4 米根霉菌Rho18粗提酶液对DON的清除率†

† 小写字母不同表示同列间的差异显著(P<0.05)；大写字母不同表示同行间的差异显著(P<0.05)；“-”表示DON清除率为0%。

由表4可知，小麦粉样品与不同浓度组的Rho18粗提酶液孵育不同时间后，高浓度组的DON清除率均显著高于相同孵育时间下的低浓度组(P<0.05)，高浓度组孵育10 h后对DON的清除率可达40.84%，低浓度组经过不同孵育时间处理后无显著差异。以上结果表明，Rho18粗提酶液对小麦粉中的DON有清除作用，作用效果受酶的作用时间、浓度影响，在高浓度下，清除效果会随着时间的延长而增加。粗提酶液的主要成分是Rho18稳定期的胞外酶，包括淀粉酶、脂肪酶等，此阶段酶活性较高。淀粉酶可将小麦淀粉水解为极限糊精，糊精对小分子物质具有一定的包埋作用[17]，可固化DON毒素，从而降低DON毒素的检出量；脂肪酶能够催化水解环氧化合物，可以将DON转化为DOM-1[15]，其毒性为DON的1/55[18]。多种酶类的综合作用，间接或直接降低了小麦淀粉中DON毒素的含量。

2.5 不同浓度Rho18细胞壁对DON的清除效果

不同浓度的Rho18细胞壁悬液对小麦粉样品中DON的清除率如表5所示。

由表5可知，小麦粉样品与不同浓度组的Rho18细胞壁悬液混合作用，经5 h孵育后，低浓度组(4.54%)显著低于高浓度组(P<0.05)；处理10 h后，与处理5 h相比高浓度组对DON的清除率显著提高(P<0.05)，低浓度组相较无显著差异。以上结果表明，Rho18的细胞壁对小麦粉中的DON毒素有一定的清除效果。

有研究[19]表明，微生物细胞壁对真菌毒素的清除作用可能包括物理吸附和生物降解。细胞壁的吸附作用主要是通过其中的肽聚糖、甘露聚糖和葡聚糖等高分子物质实现[16]。米根霉细胞壁的主要成分为几丁质和壳聚糖[20]，其中壳聚糖是米根霉细胞壁结构性多糖的主要成分，且大部分含1.28%左右的胺基，具有良好的吸附作用[21]。细胞壁的生物降解作用可能与细胞壁表面的酶类有关。米根霉菌细胞壁的壳聚糖对于酶具有良好的固化作用[22]，可同时吸附、固化某些酶。同时，细胞壁表面存在的一些具有类似于酶活性作用的表面蛋白，对DON也可能具有一定的降解作用。此外，米根霉菌细胞壁对金属离子具有一定的吸附作用，Meng等[23]以米根霉细胞壁制备了同时可吸附Ni2+和Fe3+的双吸收剂，张亚娟[24]发现黑根霉对Cd2+、Cr6+、Pb2+等重金属有较高的吸附能力。金属离子能够与酶结合成金属蛋白酶，对于酶的活性存在积极的影响[14]。因此，高浓度的Rho18细胞壁具有较高的DON清除能力可能与这些金属离子能够辅助米根霉菌细胞壁清除DON有关。

表5 米根霉菌Rho18细胞壁对DON的清除率†

† 小写字母不同表示同列间的差异显著(P<0.05)，大写字母不同表示同行间的差异显著(P<0.05)；“-”表示DON清除率为0%。

由表1～5可以看出，经过同一处理方式处理的米根霉Rho18与小麦粉样品混合，其清除率与时间呈正比关系。不同方式处理的Rho18对小麦粉中DON的清除效果存在差异，其中细胞壁对DON的清除效果最好，其次是发酵上清液。米根霉菌Rho18所产的酶大部分为初级代谢产物，且细胞内外均存在[25]。试验所制备的Rho18全菌裂解液、粗提酶液中均含有一定比例的酶或小分子代谢物质，但因各成分液所含酶系及有机物质种类存在差异，而导致不同处理的Rho18对DON的清除率存在差异。细胞壁对DON毒素除由于结构特性而存在吸附作用外，其固化的酶对于DON毒素也可能存在清除作用，因而细胞壁对DON毒素的清除效果较好。

2.6 DON降解产物的定性分析

高浓度的Rho18用不同处理方式后，与小麦粉共同孵育10 h，用LC-MS测定DON的降解产物，测定结果如图1所示。

图1 高浓度Rho18不同处理方式孵育10 h后降解产物的LC-MS图谱

由图1可知，DON标准品的相对分子质量为293.30，经过Rho18菌悬液、发酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液以及细胞壁悬液处理10 h后，均产生相对分子质量为277，281左右的两种新物质，其中DON经Rho18悬液处理后可产生相对分子质量为279，281左右的两种物质。以上结果表明，不同处理方式的Rho18可通过生物降解DON产生新的物质。

相关研究[16,26]显示，DON在糖苷酶作用下可进行3C-糖苷化，生成低毒性的降解产物；同时，DON作为烯醇类化合物，含有环氧基团和羟基，环氧化合物在脂肪酶作用下可被水解。乐华爱等[27]研究证实根霉菌可产生高活性的糖苷酶，可降解DON。此外，根霉菌可产生脂肪酶[28]、酸性蛋白酶以及酒化酶系[29]，但这些酶系是否具有开C12/C13环氧基，或是在复杂酶系作用下与有机酸发生酯化反应，进一步氧化或分解DON，还需进一步论证。

3 结论

试验结果表明，米根霉菌Rho18对DON的清除率因处理方式、浓度及孵育时间而不同，其中高浓度的Rho18细胞壁悬液与小麦粉孵育10 h后，小麦粉中呕吐毒素的清除率最高(51.62%)，其作用机制可能与Rho18细胞壁对DON生物降解和物理吸附作用有关。LC-MS测定结果表明，经不同方式处理的米根霉Rho18与DON作用后均有新物质生成，可能与根霉菌丰富且高活性的酶系有关，但具体由何种酶系发挥主要作用，仍需进一步研究。