门万琪,杨汉蕾,张 科,杨 林,许士刚,牟 荣

亚洲带绦虫(Taenia asiatica)是一种常见的人兽共患寄生虫,人是唯一终宿主[1]。这种带绦虫主要分布在亚太部分地区[2],近年还在印度北部地区和老挝发现该虫种[3-4]。亚洲带绦虫的流行与当地人们不良的饮食和生活习惯有关,而它的感染则直接危害人和家畜的健康[5]。亚洲带绦虫的最适宜中间宿主是猪,囊尾蚴一般寄生于肝脏,导致肝组织的病理变化。前期研究发现囊尾蚴的寄生可以引起肝脏的急慢性炎症反应、肝细胞凋亡及肉芽肿形成等多种病理变化[6]。

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)是生物体内重要的信号转导系统之一。MAPK信号通路主要包括细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK),c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal protein kinase,JNK)和p38MAPK,MAPK通路对细胞增殖,细胞分裂及分化,应激和炎症反应等产生重要作用[7]。MAPK信号通路在寄生虫感染宿主过程中参与宿主细胞对有丝分裂原、热休克蛋白和促炎细胞因子等多种刺激的反应,还参与调节细胞增殖,基因表达,细胞存活和凋亡等功能[8]。近年来,课题组相关研究发现,亚洲带绦虫感染乳猪后可显著影响肝细胞MAPK通路主要激酶基因的表达并抑制肝细胞生长[9]。另外,Lin R等[10]在研究感染多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)的小鼠肝脏基因表达谱后发现MAPK信号通路主要激酶基因均出现上调表达并影响肝细胞的增殖。

目前用CCK-8法和流式细胞术对寄生虫感染宿主组织细胞的损伤作用进行研究。常见的ERK、p38和JNK抑制剂分别是U0126、SB203580和SP600125。Smout MJ等[11]研究发现U0126可以抑制华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)分泌蛋白所致小鼠成纤维细胞增殖。Jin X等[12]研究发现SB203580可以抑制犬新孢子虫(Neospora caninum)对牛肾细胞的侵袭作用。Wu Y等[13]研究华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)分泌蛋白可激活肝形状细胞(Hepatic stellate cell,HSC),而SP600125能抑制JNK活性,抑制HSC过度增殖。但目前尚无U0126、SB203580和SP600125对亚洲带绦虫感染中间宿主乳猪肝细胞MAPK通路影响的研究报道。本研究在建立亚洲带绦虫感染和MAPK特异性抑制剂干预的动物模型基础上,分别采用CCK-8法、流式细胞术和RT-PCR检测肝细胞生长抑制率、细胞凋亡率以及ERK1、p38和JNK1基因的表达水平,以了解MAPK特异性抑制剂干预后感染肝细胞MAPK信号通路相关基因表达、细胞活力和细胞凋亡的变化,探究MAPK特异性抑制剂是否能够减轻亚洲带绦虫所致乳猪肝组织损伤,进一步为抗囊尾蚴病的药物研发及囊尾蚴病的治疗提供新的、有价值的基础资料。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 虫体来源 亚洲带绦虫标本采自贵州省都匀市墨冲镇。对近期有排节片患者用槟榔-南瓜子法驱虫,经形态学观察和分子生物学鉴定,确定采集虫体为亚洲带绦虫并收集成虫孕节和虫卵。

1.1.2 实验动物 30头20 d龄约克二元施格杂交乳猪,动物批号[2017-151],体重3.4～7.5 kg,体健,经粪检和间接血凝集试验证实无猪囊虫等寄生虫感染,购自贵州省龙里县种猪养殖基地。

1.1.3 主要试剂和仪器 Trizol试剂购自美国sigma公司,荧光定量PCR试剂盒和和cDNA合成试剂盒购自日本TAKARA公司,氯仿、异丙醇和乙醇均购自上海国药集团,cck一8试剂购自北京康为世纪公司,PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。荧光定量PCR仪(7300)为美国ABI公司产品,酶标仪(μ一Quant)为美国Bio—Tek公司产品。

1.2 方 法

1.2.1 虫卵收集和计数 取每条亚洲带绦虫成虫后部10～20节孕节,在盛有生理盐水的培养皿中以细针沿纵轴划破孕节使虫卵溢出,并反复用生理盐水清洗,装入试管以2 000 r/min离心20 min,收集虫卵备用。光学显微镜下观察收集的虫卵并分别计数5次,取平均值,定量1 mL生理盐水中虫卵数为15万个备用。

1.2.2 实验动物感染和标本采集 乳猪随机分为5组,即正常对照组4头、实验组5头、U0126抑制剂干预组、SB203580抑制剂干预组和SP600125抑制剂干预组各7头,实验组以定量虫卵15万个/头通过胃管灌胃感染。上述3组抑制剂干预组自灌胃之日起每头乳猪分别腹腔注射抑制剂U0126、SP600125、SB203580 1 mg/kg,隔天1次,连续注射7次。各组在封闭环境下同条件饲养。于感染后第15 d麻醉处死所有组乳猪,采集对照组、实验组和各抑制剂干预组乳猪肝组织,并剥除实验组囊尾蚴。将各组肝组织放入冷冻管或有1 mL Trizol的EP管中,保存于-80℃冰箱备用。

1.2.3 CCK-8法检测乳猪肝细胞生长抑制率 将-80℃冰箱取出的肝组织先用1640培养液冲洗后置于平皿中,再用注射器针头轻轻研磨,边研磨边以1640培养液冲洗,直至组织研磨完全。收集肝组织细胞悬液,经300目尼龙网过滤,1 500 r/min离心5 min,再以1640培养液重悬细胞。调整各组肝细胞悬液浓度为5 000个/mL,以每孔100μL细胞悬液量接种于96孔板,每孔再加入10μL CCK-8,于37℃、5%CO2的条件下培养2 h后,在450 nm波长处读取光密度值。以对照组作为阴性对照,按公式计算实验组和各抑制剂干预组肝细胞生长抑制率:细胞生长抑制率＝(1-实验组OD值/阴性对照组OD值)×100%。对照组、实验组和各抑制剂干预组各选取3个样本检测,每个样本各做6孔。

1.2.4 流式细胞仪测定乳猪肝细胞凋亡率 取各组肝细胞悬液,每组肝细胞5×104个,1 000 r/min离心5 min,再用500μL AnnexinⅤ-FITC结合液重悬细胞,然后加入15μL Annexin V-FITC,4℃避光孵育15 min。加入5μL PI染液5 min后,上机检测并分析细胞凋亡率。

1.2.5 实时荧光定量PCR检测 根据GenBank相关序列,使用上海生工公司在线软件设计ERKl、JNKl、p38和β肌动蛋白(β-actin)实时荧光定量PCR引物,并由其合成(表1)。采用Trizol一步法提取各组乳猪肝组织总RNA,按试剂盒说明操作获得逆转录cDNA。PCR反应条件:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,60℃退火34 s,72℃延伸30 s,共40个循环。记录荧光定量PCR仪得出的各组目的基因和内参基因的CT值,重复3次取平均值。计算目的基因的△△CT值,采用2-△△CT法计算出各组目的基因的相对表达量。

表1 荧光定量PCR引物Tab.1 Primers for Quantitative Real-Time PCR

1.2.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析处。1)数据的正态性分析。2)实验数据以±s表示,采用单因素方差分析比较各组间差异,组间两两比较视方差齐性采用LSD法(齐),P＜0.05差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 亚洲带绦虫虫卵实验感染乳猪结果 感染后第15 d,实验组肝脏和各抑制剂干预组肝脏均可见白色细小点状结构,未见清晰囊尾蚴结构(图1)。实验总共感染乳猪26头,其中感染组5头,3种抑制剂干预组21头。乳猪囊尾蚴感染率为100%。

图1 亚洲带绦虫感染后不同组乳猪肝脏外观,箭头所示为囊尾蚴Fig.1 Liver appearance of different groups of porkets after infection with Taenia asiatica,↑indicated cysticercus

2.2 CCK-8法测乳猪肝细胞的生长抑制率 感染组肝细胞生长抑制率为(23.11±1.26)%,U0126组生长抑制率为(16.48±0.7)%,与感染组相比(t＝9.223,P＜0.001);SB203580组生长抑制率为(12.59±1.2)%,与感染组相比(t＝11.532,P＜0.001);SP600125组生长抑制率为(18.3±0.75)%,与感染组相比 (t＝6.775,P＜0.001);各干预组均较感染组的生长抑制率明显降低(图2)。

图2 感染组和抑制剂干预组乳猪肝细胞的生长抑制率(±s)%Fig.2 Growth inhibition rate of hepatocytes in infection group and inhibitor intervention group(±s)%

2.3 流式细胞仪检测乳猪肝细胞凋亡率 流式细胞仪的细胞点图示:流式细胞分析图的左下区(LL)为正常活细胞,右下区(RL)为早期凋亡细胞;右上区(RU)为晚期凋亡或死亡细胞,左上区(LU)为收集过程中损伤的细胞(图3)。对照组肝细胞凋亡率为(13.44±1.6)%,感染组(18.21±1.1)%与对照组相比(t＝-4.282,P＜0.05);U0126组为(26.12±3.3)%,与对照组相比 (t＝-5.998,P＜0.01),差异有统计学意义;与对照组相比,SB203580组为(15.34±1.4)%(t＝-1.548,P＞0.05),SP600125组为(16.22±2.7)%(t＝-1.545,P＞0.05),此两组的肝细胞凋亡率与对照组无统计学差异;与感染组相比,U0126干预组的肝细胞凋亡率增高,差异有统计学意(t＝-5.934,P＜0.001),SB203580干预组的肝细胞凋亡率较感染组降低,差异有统计学意义(t＝3.821,P＜0.01),SP600125干预组的肝细胞凋亡率较感染组相比,差异无统计学意义(t＝1.188,P＞0.05)(图4)。

2.4 实时荧光定量PCR检测乳猪肝细胞ERK1、p38、JNK1的mRNA相对表达量的变化 与对照组相比,感染组(t＝-10.739,P＜0.05)和 U0126干预组(t＝-4.157,P＜0.05)的 ERK1 mRNA 相对表达量增高,差异有统计学意义;与感染组相比,U0126干预组ERK1 mRNA相对表达量降低,差异有统计学意义(t＝3.462,P＜0.05);与对照组相比,感染组(t＝-8.227,P＜0.01)和SB203580干预组(t＝-3.118,P＜0.01)p38 mRNA相对表达量增高,差异有统计学意义;与感染组相比,SB203580干预组p38 mRNA相对表达量降低,差异有统计学意义(t＝3.267,P＜0.05);与对照组相比,感染组(t＝2,887,P＜0.05)和SP600125干预组(t＝10.392,P＜0.05)JNK1 mRNA的相对表达量降低,差异有统计学意义;与感染组相比,SP600125干预组JNK1 mRNA的表达量降低,差异有统计学意义(t＝3.363,P＜0.001)(图5)。

图3 乳猪肝细胞流式检测图Fig.3 Flow cytometry figure of porcine hepatocytes

图4 对照组、感染组和三种抑制剂干预组乳猪肝细胞的凋亡率Fig.4 Apoptosis rate of liver cells of suckling pigs in control group,infection group and three inhibitor intervention groups

3 讨 论

寄生虫的感染可影响宿主组织细胞MAPK通路中相关基因的表达导致该通路的激活并产生相应的生物学效应。Han S等[14]研究认为大鼠肝细胞炎症和凋亡与华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)感染激活肝细胞MAPK信号通路有关。课题组前期研究也发现亚洲带绦虫幼虫在乳猪体内发育过程中可影响肝脏MAPK通路中ERK1/2、p38和JNK1基因的表达水平[9]。有研究表明,通过抑制MAPK通路ERK1/2、p38和JNK1基因表达,能够减轻阴道毛滴虫感染导致的炎症反应[15]。MAPK信号通路特异性抑制剂可抑制相应通路的激活,减轻寄生虫感染后MAPK信号通路活化而产生的各种组织细胞病理损伤[11-13]。常见的MAPK信号通路抑制剂有 ERK 抑制剂(U0126)、p38MAPK 抑制剂(SB203580)和JNK抑制剂(SP600125)等,这些抑制剂可作用于MAPK通路的相应位点,从而抑制通路激活,可能具有治疗某些癌症的潜力[16-17]。

图5 感染组和U0126干预组ERK1基因、SB203580干预组p38基因、SP600125干预组JNK1基因mRNA相对表达量Fig.5 Relative expression of ERK1,p38 and JNK1 mRNA in infection group and three inhibitor intervention groups

研究表明肝脏内寄生虫可通过激活MAPK通路来抑制肝细胞生长。Liu P等[18]发现日本血吸虫卵抗原可激活小鼠肝细胞MAPK通路中p38和JNK蛋白激酶并抑制肝星状细胞增殖。我们前期研究也发现亚洲带绦虫感染可通过改变MAPK通路中ERK1、p38和JNK基因表达来抑制肝细胞生长[9]。本研究使用3种抑制剂(U0126、SB203580和SP600125)对亚洲带绦虫感染乳猪进行注射干预,结果显示3种抑制剂干预组的乳猪肝细胞生长抑制率均较感染组明显降低。由此可见,经3种抑制剂干预,亚洲带绦虫幼虫寄生所致的乳猪肝细胞生长抑制率明显减低,有利于肝细胞生长。这可能与乳猪肝细胞中激活的MAPK通路被抑制有关,经特异性抑制剂阻断后,肝细胞中MAPK信号通路相关基因的表达被抑制,从而影响了细胞的生长、增殖和凋亡。

此外,研究表明MAPK信号通路抑制剂可以影响寄生虫的生长发育和寄生虫对宿主的侵袭力。Cheng Z等[19]在研究U0126对多房棘球绦虫(E-chinococcus multilocularis)泡球蚴生发细胞的作用中发现U0126抑制了虫体生发细胞的增殖和生长。本实验发现U0126明显降低乳猪肝细胞生长抑制率,从而促进乳猪肝细胞生长,推测可能与亚洲带绦虫幼虫在乳猪肝脏内生长发育中也受到U0126抑制有关。由于U0126可能抑制亚洲带绦虫幼虫体内MAPK信号通路中主要参与细胞增殖、分化、转录调节和发育等过程的ERK1/2途径,该途径的激活受到抑制可能会干扰幼虫在乳猪肝脏内的生长发育进程,以减轻幼虫对肝组织的破坏和损伤,进而减缓肝细胞的生长抑制,具体机制尚有待进一步研究。另外,Jin X等[12]研究发现SB203580可显著降低犬新孢子虫(Neospora caninum)自身的运动能力和对牛肾细胞的侵袭作用。Bussière FI等[20]比较3种MAPK通路抑制剂(PD98059,SP600125和SB203580)在柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)对宿主肠道上皮细胞侵袭性的影响研究中发现,SP600125和SB203580能显著抑制该虫对肠上皮细胞的侵袭力。由此我们推测,本实验中SB203580和SP600125也可能通过降低亚洲带绦虫幼虫在乳猪体内的活动能力或者抑制其对乳猪肝脏的侵袭作用,以减轻幼虫对肝脏组织细胞的破坏,从而减少肝细胞损伤,使得肝细胞的生长抑制率降低,促进肝细胞生长。

MAPK信号通路是细胞凋亡过程中的关键参与者,但通路中不同级联的激活对细胞凋亡的调节有所差异。研究表明MAPK信号通路中ERK基因的上调表达,ERK途径激活可以促使细胞存活、减少细胞凋亡[21]。而MAPK信号通路中p38和JNK途径的激活则促进细胞凋亡[22]。课题组前期研究结果显示,亚洲带绦虫幼虫感染乳猪肝脏后可致乳猪肝细胞凋亡增加[6]。Tsai JJ等[23]研究发现瑞格列尼(regorafenib)通过抑制SK-HEP-1细胞中的ERK和NF-κB途径而促进细胞凋亡,表明抑制MAPK信号通路中的ERK途径可以增加SKHEP-1细胞凋亡。Aoki Mdel P等[24]研究克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)感染的小鼠心肌细胞发现,抑制ERK1/2途径可增加心肌细胞凋亡率。本研究发现,U0126抑制剂干预组的肝细胞凋亡率较对照组和感染组均明显升高且ERK1 mRNA表达水平降低。由此推测,U0126抑制剂干预组乳猪肝细胞期凋亡增加可能与ERK1/2途径的抑制有关,U0126可能通过下调乳猪肝细胞ERK1 mRNA表达水平来抑制ERK途径,导致乳猪肝细胞凋亡率增加。

另外,研究表明有些原虫可通过抑制JNK或p38 MAPK途径来减少宿主细胞的凋亡率。Rodríguez-González J等[25]在墨西哥利什曼原虫(Leishmania mexicana)无鞭毛体感染树突状细胞(Dendritic cells,DC)的研究中发现无鞭毛体通过减少p38 MAPK和JNK的磷酸化,抑制被感染DC细胞的凋亡,以延长DC的存活。Chang JH等[26]研究证明SB203580的干预治疗可持续阻断阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)导致的人巨噬细胞凋亡。Sreekanth GP等[27]研究登革热病毒(DENV)感染BALB/c小鼠肝脏发现,SP600125可抑制JNK1/2磷酸化,减少细胞凋亡,减轻肝损伤。本实验发现,SB203580与SP600125干预组乳猪肝细胞p38和JNK1 mRNA表达水平降低,且肝细胞凋亡率较感染组明显降低并且与对照组比较差异无统计学意义,说明SB203580与SP600125可明显减少因亚洲带绦虫幼虫感染所致的肝细胞凋亡。我们推测SB203580和SP600125可能通过下调p38和JNK1 mRNA表达来抑制p38和JNK途径,以减少肝细胞凋亡的发生。

综上所述,本实验发现亚洲带绦虫感染可明显影响乳猪肝细胞ERK1、p38和JNK1基因mRNA水平,特异性抑制剂可以通过改变乳猪肝细胞MAPK相关基因的mRNA水平减轻肝细胞的生长抑制和细胞凋亡,而在亚洲带绦虫感染乳猪肝脏的病理生理变化过程中,抑制剂是如何通过抑制不同底物磷酸化以及是否同时调节通路中其他相关基因的表达值得进一步研究。

利益冲突:无

引用本文格式:门万琪,杨汉蕾,张科,等.MAPK通路主要激酶抑制剂对亚洲带绦虫感乳猪肝细胞生长抑制率和凋亡率的影响[J].中国人兽共患病学报,2019,35(9):797-804.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.084