高效液相色谱法测定阿德福韦的含量

2019-10-14黄励坚

肇庆学院学报 2019年5期

黄励坚

（广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，广东肇庆 526040）

阿德福韦酯是一种新型治疗乙肝药物，被人体吸收后能迅速水解为阿德福韦，因此该药起到抗病毒作用的是阿德福韦，其学名为9-[2-(膦酰甲氧基)乙基]腺嘌呤；9-[2-(磷酸甲氧基)乙基]腺嘌呤.研究拟建立一种专属性强、灵敏度高、操作简单的阿德福韦含量测定方法，为阿德福韦人体代谢动力学研究提供支持.

1 仪器与试剂

1.1 仪器

1100高效液相色谱分析仪(安捷伦）；色谱柱：Zorbax SB-Aq；PHS-3C pH计（雷磁）；十万分之一分析天平（梅特勒-托利多XSE）；KQ3200型超声波清洗器(昆山超声仪器厂有限公司).

1.2 药品与试剂

阿德福韦对照品（中国食品药品检定研究院，批号101359-201501,含量100%）；乙腈，色谱纯；氢氧化钠，分析纯；磷酸，分析纯；磷酸二氢铵，分析纯；去离子水.

2 方法与结果

2.1 液相色谱条件

色谱柱：Zorbax SB-Aq(填料粒径5 μm，规格4.6 mm×250 mm).

流动相.溶液A：置1.15 g磷酸二氢铵（NH4H2PO4）于1 000 mL去离子水中，混合均匀，用10%磷酸溶液调pH值至3.50±0.05，混合均匀，经0.45 μm尼龙膜过滤并脱气；溶液B：HPLC级乙腈.按照表1程序洗脱.

柱温：30 ℃；流速1ml·min-1；进样量10μl；检测波长260 nm.

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液配制

标准品储备液（1 000 μg·ml-1）：精密称量25 mg阿德福韦标准品到25 ml容量瓶中，加0.1 mol·L-1氢氧化钠1.0 ml，加5ml去离子水，超声至完全溶解，用去离子水稀释至刻度，混匀.

标准品对照溶液（100μg·ml-1）：移液管移取10.0 ml标准品储备液到100 ml容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，混匀.

样品供试液（100μg·ml-1）：精密称量25 mg阿德福韦供试品到25 ml容量瓶中，加0.1 mol·L-1氢氧化钠1.0 ml，加5 ml去离子水，超声至完全溶解，用去离子水稀释至刻度，混匀；移液管移取10.0 ml到100 ml容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，混匀.

用去离子水做为空白样品溶液.

2.3 方法学考察

专属性考察：取2.2项下对照品溶液适量，按拟订色谱条件进样对照品溶液、供试品溶液及空白样品(离子水)溶液进行分析，色谱图见图1～图3.在该条件下，样品分离良好.

图1 空白溶液高效液相色谱图

图2 对照品溶液高效液相色谱图

图3 供试品溶液高效液相色谱图

线性关系考察：用不同体积移液管精密量取2.2项下标准品储备液至不同体积容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，制成系列质量浓度溶液（20.0、50.0、100.0、200.0、250.0、400.0μg·ml-1）.按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图.以药物浓度对峰面积做线性回归，得回归方程为：Y=30.739X-14.777,R=1,结果显示阿德福韦在20.0～400.0μg·ml-1范围内，线性关系良好.

精密度试验：取2.2项下对照品溶液适量，加去离子水分别稀释制成低、中、高质量浓度(20.0、50.0、100.0 μg·mL)的对照品溶液，各分别重复进样6次，记录峰面积.结果RSD分别为0.56%、0.68%、0.89%(n=6),表明仪器精密度良好.

重复性试验：取2.2项下对照品溶液适量，加去离子水分别稀释制成供试液（100μg·ml-1）6份，依次测量，记录图谱，外标法计算含量，按照含量计算RSD=0.27%(n=6),表明实验重复性良好.

中间精密度试验：取2.2项下对照品溶液适量，加去离子水分别稀释制成供试液（100μg·ml-1）6份，由第二人在另一台仪器上测量，记录图谱，外标法计算含量，加上重复性实验的6个共12个含量值，计算得到RSD=0.20%(n=12),表明实验精密度良好.

稳定性试验：配置供试液（100μg·ml-1），分别于0、2、4、6、8 h进样，记录图谱，以峰面积计算RSD=0.31%(n=5),表明室温下供试品溶液在8 h内稳定.

回收率试验：分别精密称量20、25、30 mg阿德福韦到25 ml容量瓶中，加0.1 mol·L-1氢氧化钠1.0 ml，加5 ml去离子水，超声至完全溶解，用去离子水稀释至刻度，混匀.移液管移取10.0 ml到100 ml容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，混匀，形成相当于供试液浓度80%、100%、120%的样品，每个浓度配3份，进行液相测量，记录图谱，外标法计算每个浓度的回收率、平均回收率、RSD，以及9个样品回收率RSD，结果见表2：